Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
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Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolierung von Neurosphären aus der erwachsenen Maus-Gehirn <ol><li> Euthanize einen erwachsenen Maus (etwa 2 Monate alt) durch eine Überdosis Isofluran. Doppelklicken Sie sicher, dass die Maus Atmung und seziert unmittelbar nach dem Tod gestoppt hat. </li><li> Mit einer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt, den Schädel zu öffnen. Entfernen Sie das Gehirn. </li><li> Legen Sie das Gehirn in kaltem PBS in einer 10 cm Schale auf Eis. Folgen Sie der whole-mount Dissektion Methode 48 ...

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung und Neurosphere Kulturen von adulten Maus SVZ zu halten. Einige relevanten Punkte, die Kulturen in Bezug auf sind wie folgt. Erstens sind die Größen der Kugeln typischerweise zwischen 50 bis 200 &amp; mgr; m. Unserer Erfahrung nach, wenn ein Neurosphere größer als 300 &amp; mgr; m im Durchmesser bekommt, hat die optimale Zeit für Passagierung verfehlt. Diese größeren Kugeln enthalten tote Zellen im Kern. Zweitens, wie Neurosphären üblicherweise verwendet werden, ...

Das primäre cilium ist ein Mikrotubulus-basierte dynamischer subzellulären Kompartiment, das als sensorische Antenne in zellulären Signalweg koordinierenden, einschließlich der Sonic Hedgehog (Shh) -Weg während der embryonalen neuronalen Entwicklung 1, 2 und compartmentalized subzellulären Signalgebung in adulten neuronalen Funktion 3, 4 . Signalisierungs Komponenten dieser Wege, wie der Shh - Rezeptor 5 Patched; der Weg Aktivator Smoothened (Smo) 6; und Gpr161 7 ein Orphan - G - Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) , die sich negativ auf die Shh - Weg reguliert, lokalisieren Zilien in einer dynamischen Art und Weise. Multiple GPCRs wurde auf die Zilien in Neuronen im Gehirn 7, 8, 9, 10 lokalisieren berichtet </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekte in Cilien und Zilien generierte Signalwege beeinflussen multiple Gewebe und werden als Ziliopathien 17, 18, 19 gemeinsam bekannt. Das Ziliopathie Krankheitsspektrum umfasst häufig die Entwicklung des Nervenstörung, wie kraniofazialen Anomalien 20, 21, 22. Außerdem regulieren primären Zilien in hypothalamischen Neuronen zentralen Sättigungswege und führen Defekte in 23 zentrale Fettleibigkeit, Übergewicht in syndromic Ziliopathien wie Bardet Biedel Syndrom 24 Spiegelung. Zusätzlich Signalisierungsneuropeptid-Rezeptor in Cilien reguliert central Sättigungsweg 11, 14. Ciliary Lokalisierung von Adenylylcyclase III (ACIII) und GPCRs wie Somatostatin - Rezeptor 3 in Hippokampus - Neuronen führt in neuartigen Objekterkennungsfehlern und Gedächtnisdefiziten 25, 26 und verläuft parallel einen Mangel an Integrität ciliary 27. Die Entwicklungsaspekte der Zilien-generated-Signalisierung sind eng mit Gewebshomöostase gebunden; insbesondere sind Zilien wichtig für die Progression von Shh-Subtyp Medulloblastom aus Granulat Vorläufern im Cerebellum 28, 29 entstehen. So spielen primäre Zilien eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, nach der Geburt, und adulter neuronaler Entwicklung und Funktion. Neuronale Stammzellen (NSC) befinden sich in der Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel, die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und derventrikulären Zone des dritten Ventrikels im Hypothalamus bei Säugetieren 30, 31, 32. NSCs sind multipotent , besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind wichtig für die Entwicklung des Gehirns und der regenerativen Medizin 30. Die meisten NSC in dem SVZ sind ruhende und besitzen ein einsames primäres cilium , die, in vielen Fällen 33 an den lateralen Ventrikel erstreckt. Die primären cilium Signale über die Lokalisierung der verschiedenen Rezeptoren, nachgeschaltete zelluläre Antworten zu induzieren, insbesondere in Bezug auf Shh, TGFß, und Rezeptor - Tyrosin - Kinase - Wege 2, 34, 35, 36. Da primäre Zilien in die lateralen Ventrikel erstrecken, wird die Hypothese aufgestellt , dass die primären Zilien Cytokine in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) erfassen , 37 zu aktivieren NSC </sup&gt;. Neuere Studien legen nahe , dass der Shh - Signalweg und primäre Zilien sind entscheidend für die Aktivierung von Stammzellen bei der Reparatur und Regeneration von mehreren Geweben, einschließlich dem Riechepithel, Lunge, Niere und 38, 39, 40, 41. Jedoch kommuniziert die Mechanismen, durch die CSF mit NSC und ob primäre Zilien beteiligt sind, sind nicht bekannt. Adhärenten NSCs in Kultur sind bewimpert; Shh Stoffwechselweg Komponenten wie Smo und Gpr161 in Cilien lokalisieren; und Shh reaktions 42. Somit kann NSC als wichtiges Modellsystem dienen der Shh Stoffwechselweg, ciliary Handel und neuronalen Differenzierungswege zu untersuchen. Darüber hinaus von NSCs differenzierten Neuronen können auch für ciliare Handels-Assays verwendet werden. Neurosphären werden von Clustern von frei schwebenden Zellen gebildet aus der Proliferation von NEURA ergebendenl Stammzellen / Vorläuferzellen , die in Anwesenheit von spezifischen Wachstumsfaktoren und nicht klebender Oberflächen 43, 44 wachsen. Neurospheres dient in vitro Kulturmodellen als wichtiges neuralen Stamm- / Vorläuferzellen in der normalen Entwicklung und Krankheit 31, 45, 46, 47 zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Neurosphäre basierende Assay zur Kultivierung von neuralen Stamm- / Vorläuferzellen und zur Differenzierung zu Neuronen / Glia. Wir betonen , insbesondere den Handel mit Komponenten Zilien neuraler Stammzellen / Vorläuferzellen und differenziert Neuronen (Figur 1) signalisiert. Im Gegensatz zu primären Neuronen Kulti, sind primäre Neurosphären relativ leicht zu Kultur, zugänglich sind, um mehrere Durchgänge und Gefrier-Auftau-Zyklen, und die Differenzierung zu Neuronen / Glia eingehen können. Wichtig ist, stellten wir fest, dass die Neurosphäre abgeleiteten neuralenStamm- / Progenitorzellen und differenzierte Neuronen in Kultur bewimpert und lokalisieren Moleküle relevant Zilienfunktion in diesen Kompartimenten Signalisierung. Neurosphere Basis Kultivierungsverfahren kann als ein ideales Modellsystem dienen zur Untersuchung von ciliogenesis und ciliare Handel in NSCs und differenzierten Neuronen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Die Zellen aus dem SVZ in NSC - Medium für eine Woche nach dem Plattieren floating Neurosphären wurden (2A) beobachtet. Die Größen der Kugeln variiert zwischen 50 und 200 um. Um zu untersuchen, ob die Kugeln aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen abgeleitet wurden, wurden die Neurospheres ausplattiert PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC-Medium für 2 Tage. Sie wurden dann immunhistochemisch gegen die neuralen Stammzellen / Vorläuferzellmarker, Nest...

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Das primäre cilium ist von fundamentaler Bedeutung in neuralen Vorläuferzellproliferation, die neuronale Differenzierung, und adulten neuronalen Funktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren ciliogenesis und den Handel mit Signalproteinen zu Zilien in neuralen Stamm- / Progenitorzellen und differenzieren Neuronen unter Verwendung von primären Kulturen Neurosphäre zu studieren.

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

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Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

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Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

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Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

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Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...