Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
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Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolamento di neurosfere dal cervello di topo per adulti <ol><li> Euthanize un topo adulto (circa 2 mesi) per una dose eccessiva di isoflurano. Fare doppio verificare che il mouse ha smesso di respirare e sezionare immediatamente dopo la morte. </li><li> Utilizzando le forbici, fare un&#39;incisione mediana per aprire il cranio. Rimuovere il cervello. </li><li> Mettere il cervello in PBS freddo in un piatto di 10 centimetri sul ghiaccio. Seguire tutta montaggio metodo dissezione avere la SVZ dal ventricolo laterale...

Qui, descriviamo un metodo per generare e mantenere colture di neurosfere da SVZ topo adulto. Alcuni punti pertinenti riguardanti le culture sono i seguenti. In primo luogo, le dimensioni delle sfere sono tipicamente tra 50 - 200 um. Nella nostra esperienza, quando un neurosfere diventa più grande di 300 micron di diametro, il momento ottimale per passaging è stato mancato. Queste sfere più grandi contengono cellule morte nel nucleo. In secondo luogo, come neurosfere sono comunemente usati per studiare le cellule sta...

Cilio primario è un compartimento subcellulare dinamica microtubuli-based che funziona come antenna sensoriale nel coordinare percorsi di segnalazione cellulare, tra cui la via di Sonic Hedgehog (Shh) durante lo sviluppo embrionale neuronale 1, 2, e compartimentato segnalazione subcellulare nell&#39;adulto funzione neuronale 3, 4 . Segnalazione componenti di queste vie, come il recettore Patched Shh 5; la via attivatore Smoothened (SMO) 6; e Gpr161 7, un recettore orfano accoppiato alla proteina G (GPCR) che regola negativamente il pathway Shh, localizzarsi a cilia in modo dinamico. GPCR Molteplici sono stati segnalati per localizzare alle ciglia nei neuroni nel cervello 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Difetti di cilia e vie di segnalazione cilia generata influenzano molteplici tessuti e sono noti collettivamente come ciliopatie 17, 18, 19. Lo spettro malattia ciliopathy frequentemente include difetti neurologico, quali difetti craniofacciali 20, 21, 22. Inoltre, ciglia primarie nei neuroni ipotalamici regolare percorsi sazietà centrali, e difetti provocare obesità centrale 23, mirroring obesità in ciliopatie sindromici come Bardet Biedel sindrome 24. Inoltre, recettore neuropeptide segnalazione in cilia regola centrAl sazietà Percorsi di 11, 14. Localizzazione ciliare ciclasi III (ACIII) e GPCR come recettore della somatostatina 3 in neuroni ippocampali provocare difetti di riconoscimento dell&#39;oggetto nuovi e deficit di memoria 25, 26 e parallela una mancanza di integrità ciliare 27. Gli aspetti dello sviluppo di segnalazione cilia generati sono strettamente legate alla omeostasi tissutale; in particolare, cilia sono importanti per la progressione di medulloblastomas Shh-sottotipo derivanti da progenitori dei granuli nel cervelletto 28, 29. Così, cilia primarie svolgono un ruolo importante durante embrionale, postnatale e adulta sviluppo e la funzione neuronale. Neurali cellule staminali (NSC) risiedono nella zona sottoventricolare (SVZ) del ventricolo laterale, la zona subgranulare del giro dentato dell&#39;ippocampo, ezona ventricolare del terzo ventricolo nell&#39;ipotalamo nei mammiferi 30, 31, 32. NSC sono multipotenti, possiedono la capacità di auto-rinnovamento, e sono importanti per lo sviluppo del cervello e la medicina rigenerativa 30. La maggior parte NSC nella SVZ sono quiescenti e possiedono un cilium primario solitaria che, in molti casi, si estende verso il ventricolo laterale 33. I segnali cilium primarie tramite la localizzazione dei vari recettori, inducendo risposte cellulari a valle, in particolare in relazione alla Shh, TGFp, e del recettore tirosina chinasi vie 2, 34, 35, 36. Poiché cilia primarie estendono nel ventricolo laterale, si ipotizza che cilia primaria rilevare citochine nel liquido cerebrospinale (CSF) per attivare NSC 37 </sup&gt;. Studi recenti suggeriscono che la via di segnalazione Shh e ciglia primarie sono fondamentali per l&#39;attivazione delle cellule staminali nella riparazione e rigenerazione di tessuti multipli, tra l&#39;epitelio olfattivo, polmone, rene e 38, 39, 40, 41. Tuttavia, i meccanismi mediante i quali CSF comunica con NSC e se cilia primaria sono coinvolti non sono noti. NSC aderenti in coltura sono ciliato; localizzare componenti della via Shh, come Smo e Gpr161 in cilia; e sono Shh reattivo 42. Così, NSC possono servire come un importante sistema modello per studiare il percorso Shh, il traffico ciliare, e percorsi di differenziazione neuronale. Inoltre, i neuroni differenziati da NSC possono essere utilizzati anche per saggi traffico ciliare. Neurosfere sono costituiti da gruppi di cellule fluttuanti derivanti dalla proliferazione di neural cellule staminali / progenitrici che crescono in presenza di fattori di crescita specifici e superfici non adesivo 43, 44. Neurosfere servono come importante in modelli di coltura in vitro per studiare le cellule staminali / progenitrici neurali nello sviluppo normale e malattie 31, 45, 46, 47. Qui, descriviamo un saggio neurosfere-based per la coltura di cellule progenitrici / staminali neurali e di differenziazione in neuroni / glia. Si sottolinea in particolare il traffico di segnalazione componenti cilia di staminali neurali / cellule progenitrici e neuroni differenziati (Figura 1). Al contrario di coltura neuroni primari, neurosfere primarie sono relativamente facili da coltura, sono suscettibili di passaggi multipli e congelare-disgelo, e possono differenziarsi in neuroni / glia. È importante sottolineare che abbiamo stabilito che neurale neurosfere di derivazionecellule staminali / progenitrici e neuroni dissociati sono Ciliated in coltura e localizzare molecole di segnalazione relativi alla funzione ciliare in questi compartimenti. i metodi di coltura neurosfere-based può servire come un sistema modello ideale per lo studio del traffico ciliogenesis e ciliare in NSC e neuroni differenziati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Dopo la placcatura le cellule dalla SVZ in terreno NSC per una settimana, neurosfere galleggianti sono stati osservati (Figura 2A). Le dimensioni delle sfere variavano tra 50 e 200 um. Per esaminare se le sfere sono state derivate da cellule staminali / progenitrici neurali, le neurosfere furono piastrate su PLL- e coprioggetto in terreno NSC laminina rivestite per 2 giorni. Sono stati poi immunostained contro il marcatore staminali / progenitrici neurali delle cellule, ...

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine ​​di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie.

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

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