Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
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Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

성인 마우스 뇌에서 neurosphere를 1. 분리 <ol><li> 이소 플루 란의 과다 복용으로 (약 2 개월) 성인 마우스를 안락사. 마우스가 호흡을 중단하고 사망 직후 해부 것을 다시 확인. </li><li> 가위를 사용하여 두개골을 열 수있는 중간 선 절개를합니다. 뇌를 제거합니다. </li><li> 얼음에 10cm 접시에 차가운 PBS의 뇌를 놓습니다. 측뇌실 48에서 SVZ를 얻기 위해 전체 마운트 박리 방법을 따른다....

여기, 우리는 생성하고 성인 마우스 SVZ에서 neurosphere 문화를 유지하는 방법을 설명합니다. 다음과 같이 문화에 관한 몇 가지 관련 사항입니다. 200 μm의 - 먼저, 구의 크기는 일반적으로 50 사이이다. neurosphere 직경보다 큰 300 μm의를 가져 우리의 경험에서, 계대을위한 최적의 시간이 누락되었습니다. 이 큰 분야는 핵심에있는 죽은 세포가 포함되어 있습니다. neurosphere를 일반적으로 신경 줄기 / 전구 ...

일차 섬모는 미세 소관 기반의 동적 세포 내 구획하다는 태아 신경원 발달 (1, 2) 동안 소닉 헤지 호그 (쉬) 경로를 비롯한 세포 신호 전달 경로를 조정 감각 안테나, 성인 신경 기능 3 실형 세포 내 시그널링 4로서 기능 . 예 5 패치 (patch) 쉬 수용체 이들 경로의 구성 요소를 시그널링; 통로 활성제 평활화 (SMO) 6; 및 Gpr161 7 부정적인 쉬 경로를 조절 고아 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)가 동적 방식으로 속눈썹에 지역화. 다수의 GPCR은 10 뇌 7, 8, 9에서 신경 세포의 섬모에 지역화보고되었다 </SUP&gt; 11, 12, 13, 14, 15, 16. 섬모 및 섬모 생성 신호 전달 경로의 여러 결함이 조직에 영향을 총칭 ciliopathies 17, 18, 19로 알려져있다. ciliopathy 질환 스펙트럼 흔히 안면 이상 20, 21, 22 등의 신경 발달 결함을 포함한다. 또한, 시상 하부 뉴런의 일차 섬모 중앙 포만 경로를 조정하고 결함 등 Bardet Biedel 증후군 24 syndromic ciliopathies 비만 미러링 복부 비만 23 초래한다. 또한, 시그널링 섬모 신경 펩타이드 수용체를 조절 CENTR알 물림 14, 11 경로. 예컨대 해마 뉴런 소마토스타틴 수용체 3과 아데 닐 레이트 사이 클라 III (ACIII)의 GPCR과의 섬모 제이션은 새로운 물체 인식 결함 25, 26 기억력 결핍의 결과와 모양체 (27)의 완전성이 부족 평행. 섬모 생성 시그널링 발달 측면 밀접 조직 항상성에 연결된다; 특히, 섬모는 소뇌 (28), (29)에서 과립 전구 세포에서 발생하는 쉬 - 서브 타입 medulloblastomas의 진행에 중요하다. 따라서, 차 섬모는 배아, 출생, 성인 신경 개발 및 기능 중에 중요한 역할을한다. 신경줄 기세포 (NSCs의)의 뇌실 영역 측뇌실의 (SVZ), 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 subgranular 영역 및 상주포유류 30, 31, 32 시상 하부에서의 제 3 뇌실 심실 영역. 관한 지표는 다 능성 있습니다 자기 갱신 능력을 소유하고, 두뇌 발달 및 재생 의학 (30)에 대한 중요하다. SVZ에서 대부분 관한 지표가 대기하고, 많은 경우에, 측면 뇌실 (33)에게 확장하는 고독한 차 섬모를 가지고있다. 특히 쉬, TGFβ 및 수용체 티로신 키나제 경로 2, 34, 35, 36에 대하여 하류 세포 반응을 유도하는 다양한 수용체의 위치 파악을 통해 일차 섬모 신호. 일차 섬모가 측뇌실 내로 연장하기 때문에,이 일차 섬모는 뇌척수액 (CSF) 37 NSCs을 활성화하는 사이토 카인이 검출되는 것으로 가정 </s&gt;까지. 최근의 연구는 쉬 신호 전달 경로 및 기본 섬모는 후각 상피 세포, 폐, 신장 38, 39, 40, 41 등의 여러 조직의 수리에 줄기 세포의 활성화 및 재생을위한 중요한 것이 좋습니다. 그러나, CSF 의해 NSCs의 메커니즘과 통신 일차 섬모 여부를 알 수없는 관여한다. 문화 자기편 관한 지표는 섬모된다 이러한 섬모의 SMO 및 Gpr161로 쉬 경로 구성 요소를 로컬 화; 42 반응 쉬입니다. 따라서 관한 지표는 쉬 경로를 연구하는 중요한 모델 시스템, 섬모 인신 매매 및 신경 세포 분화 경로 역할을 할 수 있습니다. 또한, NSCs의 차별화 된 신경 세포는 섬모 인신 매매 분석에 사용할 수 있습니다. neurosphere를이 neura의 확산에서 발생하는 자유 부동 세포의 클러스터로 구성되어있다특정 성장 인자와 비 접착면 (43), (44)의 존재하에 성장 L 줄기 / 선조 세포. neurosphere를 정상적인 개발 및 질병 31, 45, 46, 47에서 신경 줄기 / 전구 세포를 연구하기 위해 체외 배양 모델에서 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 신경 줄기 / 선조 세포를 배양 및 신경 / 신경교로의 분화를위한 neurosphere 기반 분석법을 설명한다. 우리는 특히 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포 (그림 1)의 섬모 구성 요소를 신호의 인신 매매를 강조한다. 차 신경 세포를 배양 반대로, 차 neurosphere를은 문화에 상대적으로 쉽게 여러 구절 의무가 있고 사이클 해동의 동결 및 신경 / 교세포로 분화를받을 수 있습니다. 중요한 것은, 우리는 neurosphere 파생 신경을 결정줄기 / 선조 세포 및 분화 된 신경 세포 배양에서 섬모하고 이들 구획 섬모 기능에 중요한 신호 분자 지역화. Neurosphere 기반의 배양 방법은 NSCs의 차별화 된 신경 세포에서 ciliogenesis 및 섬모 인신 매매를 연구하기위한 이상적인 모델 시스템 역할을 할 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

일주일 NSC 매체에 SVZ에서 세포 도금 후 부동 neurosphere를는 (도 2A)를 관찰 하였다. 구체의 크기는 50 ~ 200㎛ 사이에서 변화. 구체는 신경 줄기 / 전구 세포에서 파생 된 경우 검사하려면 neurosphere를가 PLL-과에 도금 된 2 일 동안 NSC 매체의 커버 슬립을 라미닌 코팅. 그들은 다음 신경 줄기 / 전구 세포 마커, 네 스틴에 대한 면역 염색되었다. 이틀은 구체가 커버 슬립...

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

일차 섬모 신경 전구 세포의 증식, 신경 세포 분화, 성인 신경 기능에 근본적으로 중요하다. 여기서 우리는 ciliogenesis 및 기본 neurosphere 문화를 사용하여 신경 줄기 / 전구 세포 및 분화 된 신경 세포의 섬모에 신호 단백질의 인신 매매를 연구하는 방법을 설명합니다.

차 섬모를 연구에 차 Neurosphere 문화를 사용하여

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

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연구

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기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

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성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

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문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...