Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolering av Neurosfærer fra Adult Mouse Brain <ol><li> Avlive en voksen mus (rundt 2 måneder gammel) av en overdose av isofluran. Dobbeltsjekk at musen har sluttet å puste og dissekere umiddelbart etter døden. </li><li> Ved hjelp av saks, lage en midtlinjen snitt til å åpne skallen. Fjern hjernen. </li><li> Sett hjernen i kaldt PBS i en 10 cm tallerken på is. Flg hel-mount disseksjon metode for å oppnå den SVZ fra den laterale ventrikkel 48. </li><li> Plasser den laterale ventrikke...

Her beskriver vi en metode for å generere og vedlikeholde neurosfærekulturer fra voksen mus SVZ. Noen relevante punkter i forbindelse med kulturer er som følger. Først størrelsene av kulene er typisk mellom 50 til 200 um. I vår erfaring, når en neurosfæren blir større enn 300 mikrometer i diameter, har det optimale tidspunktet for aging vært savnet. Disse større kuler inneholder døde celler i kjernen. For det andre, som neurosfærer blir ofte brukt til å studere neuralstamceller / progenitor-celler, er det ...

Den primære cilium er et mikrotubuli-baserte dynamisk subcellulære kammer som fungerer som en sensorisk antenne for å samordne cellulære signalveier, inkludert sonic hedgehog (Shh) veien under embryonal nevronal utvikling 1, 2, og romoppdelt subcellulær signalisering i voksen neuronal funksjon 3, 4 . Aliserte komponenter av disse reaksjonsveier, for eksempel Shh reseptoren Lappet 5; veien aktivator glattes (Smo) 6; og Gpr161 7, en orphan G-protein-koblet reseptor (GPCR) som negativt regulerer Shh veien, lokalisere til cilia på en dynamisk måte. Multiple GPCRs har blitt rapportert til å lokalisere å cilia i neuroner i hjernen 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekter i cilia og cilia-genererte signalveier påvirke flere vev og er kollektivt kjent som ciliopathies 17, 18, 19. Den ciliopathy sykdom spekteret inneholder ofte nevrologiske defekter, slik som kraniofaciale abnormiteter 20, 21, 22. I tillegg, primær cilia i hypothalamus neuroner regulere sentrale metthetsfølelse veier, og defekter resultere i sentral fedme 23, speiling fedme i syndrom ciliopathies som Bardet Biedel syndrom 24. I tillegg, neuropeptid-reseptor-signalering i cilia regulerer central metthetsfølelse baner 11, 14. Ciliær lokalisering av adenylylcyklase III (ACIII) og GPCR som somatostatinreseptor 3 i hippocampalneuroner resultere i nye objekt gjenkjennelsesfeil og hukommelsessvikt 25, 26 og parallell til en mangel på integritet ciliære 27. Utviklingsområder av cilia-genererte signalering er nært knyttet til vev homeostase; Særlig cilia er viktige for utviklingen av Shh-subtype Medulloblastomas som følge av granule progenitorceller i lillehjernen 28, 29. Dermed primære flimmerhårene spiller viktige roller under embryonal, postnatal og voksen neuronal utvikling og funksjon. Neurale stamceller (NSC) ligge i subventricular sone (SVZ) av den laterale ventrikkel subgranular sone av dentate gyrus av hippocampus, og denventrikulær sone av den tredje ventrikkel i hypothalamus hos pattedyr 30, 31, 32. NSC er multi, har evne til selvfornyelse, og er viktig for hjernens utvikling og regenerativ medisin 30. De fleste NSCs i SVZ er stillestående og har en enslig primær cilium som, i mange tilfeller, strekker seg ut til den laterale ventrikkel 33. De primære cilium signalene via lokalisering av forskjellige reseptorer, indusere nedstrøms cellulære responser, spesielt i forhold til Shh, TGFp, og reseptor-tyrosin-kinase-reaksjonsveier 2, 34, 35, 36. Siden primær cilia strekker seg inn i den laterale ventrikkel, er det en hypotese at primær cilia detektere cytokiner i cerebrospinalvæsken (CSF) for å aktivere NSCs 37 </sopp&gt;. Nylige studier tyder på at den Shh signalveien og primær cilia er kritiske for aktivering av stamceller ved reparasjon og regenerasjon av flere vev, inkludert det olfaktoriske epitel, lunge, nyre og 38, 39, 40, 41. Imidlertid, de mekanismer som står i forbindelse med CSF NSCs og om primær cilia er involvert er ikke kjent. Adherente NSCs i kultur er cilierte; lokalisere shh pathway komponenter, for eksempel Smo og Gpr161 i cilia; og er Hysj responsive 42. Således kan NSCs tjene som et viktig modellsystem for å studere Shh vei, ciliær trafikk, og neuronal differensiering veier. I tillegg kan neuroner differensiert fra NSC også anvendes for ciliære trafikkriterier analyser. Neurosfærer utgjøres av klynger av frittflytende celler som stammer fra proliferasjon av neural stilk / progenitor-celler som vokser i nærvær av spesifikke vekstfaktorer og ikke-adhesive overflater 43, 44. Neurosfærer tjener som viktig in vitro kulturmodeller for å studere neuralstamceller / forløperceller i normal utvikling og sykdom 31, 45, 46, 47. Her beskriver vi en neurosfære basert assay for dyrking av nervestamceller / forløperceller og for differensiering til neuroner / gliaceller. Vi legger spesielt vekt trafikkering av signalisering komponenter til cilia av neuralstamceller / forløperceller og differensierte neuroner (figur 1). I motsetning til dyrking av primære nerveceller, primære neurosfærer er relativt enkle å kultur, er mottagelig for flere passasjer og fryse-tine-sykluser, og kan gjennomgå differensiering til neuroner / gliaceller. Viktigere, fant vi ut at neurosfære-avledet nervestilk / forløperceller og differensierte neuroner cilierte i kultur og lokalisere signalmolekyler som er relevante for ciliær funksjon i disse avdelinger. Neurosfære-baserte dyrkingsmetoder kan tjene som en ideell modellsystem for å studere ciliogenesis og ciliare handel med NSCs og differensierte neuroner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Etter utsåing av cellene fra den SVZ i NSC medium for en uke, ble det flytende neurosfærer observert (figur 2A). Størrelsene på sfærene varierte mellom 50 og 200 pm. For å undersøke om kulene var avledet fra neuralstamceller / forløperceller ble neurosfærene sådd ut på PLL- og Laminin-belagte dekkglass i NSC medium i 2 dager. De ble deretter immunostained mot nevrale stilk / stamcelle markør, Nestinmarkøren. To dager var nødvendig for å tillate kulene å f...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Den primære cilium er fundamentalt viktig i neurale stamcelle proliferasjon, neuronal differensiering, og voksen neuronal funksjon. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å studere ciliogenesis og trafikkering av signalisering proteiner til cilia i nervestammen / forløperceller og differensierte nevroner ved hjelp av primær neurosfærekulturer.

Bruke Primære neurosfærekulturer å studere Primær Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Bruke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturer av Whole føtale organer å studere utviklingsprosesser i løpet Mouse organogenesen

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generering Primær fibroblastkulturer fra Muse øre og hale Vev

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menneskelig Primær trophoblast? Trophoblast Cell Culture modell for å studere den beskyttende effekten av melatonin mot Hypoksi / Reoksygeneringen-indusert Forstyrrelse

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammere primære fostervann og membran celler Pluripotency Xeno-gratis forhold

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering og karakterisering av primære rotte ventil interstitielle cellene: en ny modell å studere Aortaklaff forkalkninger

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generasjon og dyrking av primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetisk engineering av primær mus intestinal Organoids bruke magnetisk Nanopartikkel Transduction viral vektorer for frossen snitting

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induksjon og validering av mobilnettet Senescence i primære menneskeceller

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode å isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Kultur og Transfection sebrafisk primære celler

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...