Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
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Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolamento de neuroesferas a partir do cérebro do rato adulto <ol><li> Euthanize um rato adulto (cerca de 2 meses de idade) por uma overdose de isoflurano. Verifique que o rato parou de respirar e dissecar imediatamente após a morte. </li><li> Com uma tesoura, faça uma incisão na linha média para abrir o crânio. Remover o cérebro. </li><li> Coloque o cérebro em PBS frio num prato de 10 centímetros em gelo. Siga todo-mount o método de dissecação para obter o SVZ do ventrículo lateral 4...

Aqui, descrevemos um método para gerar e manter culturas de neuroesferas de SVZ adulto mouse. Alguns pontos pertinentes sobre as culturas são as seguintes. Em primeiro lugar, as dimensões das esferas estão tipicamente entre 50-200? M. Em nossa experiência, quando um neurosphere fica maior do que 300 mm de diâmetro, o tempo ideal para passaging foi perdida. Estas esferas maiores contêm células mortas no núcleo. Em segundo lugar, como neuroesferas são comumente usados ​​para estudar as células estaminais / ...

O cílio primário é um compartimento subcelular dinâmico baseado em microtúbulos que funciona como uma antena sensorial na coordenação de vias de sinalização celular, incluindo a via de Hedgehog Sonic (Shh), durante o desenvolvimento neuronal embrionário 1, 2, e sinalização subcelular compartimentada em adulto função neuronal 3, 4 . Sinalização componentes destas vias, tais como o receptor de Shh Patched 5; o activador via de Smoothened (Smo) 6; e Gpr161 7, um receptor órfão de Proteína G-acoplada (GPCR) que regula negativamente a via de Shh, localizar aos cílios de uma forma dinâmica. Várias GPCRs têm sido relatados para localizar aos cílios em neurónios no cérebro 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defeitos no cílios e vias de sinalização gerada-cílios afectar vários tecidos e são conhecidos colectivamente como ciliopathies 17, 18, 19. O espectro da doença ciliopathy inclui frequentemente defeitos do neurodesenvolvimento, tais como anomalias craniofaciais 20, 21, 22. Além disso, cílios em neurónios hipotalâmicos regulam vias centrais de saciedade, e defeitos resultam em obesidade central 23, o espelhamento da obesidade em ciliopathies sindrómicas tais como síndrome de Bardet Biedel 24. Além disso, o receptor neuropéptido de sinalização em cílios regula central saciedade vias 11, 14. Localização ciliar de adenililciclase III (ACIII) e os GPCRs, tais como o receptor de somatostatina 3 em neurónios do hipocampo resultar em defeitos de reconhecimento de objecto novos e défices de memória 25, 26 e paralelo a falta de integridade ciliar 27. Os aspectos do desenvolvimento da sinalização gerada-cílios estão intimamente ligados a homeostase do tecido; em particular, os cílios são importantes para a progressão de meduloblastomas Shh para o subtipo que derivam de progenitores granulares do cerebelo em 28, 29. Assim, cílios desempenham papéis importantes durante embrionário, pós-natal, e desenvolvimento neuronal adulto e função. As células estaminais neurais (NSCs) residem na zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral, na zona subgranular do giro dentado do hipocampo, e azona ventricular do terceiro ventrículo no hipotálamo em mamíferos 30, 31, 32. NSCs são multipotentes, possuem a capacidade de auto-renovação, e são importantes para o desenvolvimento do cérebro e da medicina regenerativa 30. A maioria dos NSC no SVZ são quiescentes e possuem um cílio primário solitário que, em muitos casos, se estende para fora para o ventrículo lateral 33. Os sinais cílio primários através da localização de vários receptores, a indução de respostas celulares a jusante, particularmente em relação a Shh, TGFp, e receptor de tirosina-quinase vias 2, 34, 35, 36. Uma vez que os cílios se estender para o ventrículo lateral,-se a hipótese de que cílios detectar citoquinas no fluido cerebrospinal (CSF) para activar as NSC 37 </s-se&gt;. Estudos recentes sugerem que a via de sinalização de Shh e cílios são críticos para a activação de células estaminais na reparação e regeneração de vários tecidos, incluindo o epitélio olfactivo, pulmão, rim e 38, 39, 40, 41. No entanto, os mecanismos através dos quais comunica com CSF NSC e se cílios estão envolvidos não são conhecidos. NSC aderentes em cultura são ciliado; localizar os componentes da via, tais como Shh, Smo e Gpr161 em cílios; e são Shh responsivo 42. Assim, NSC pode servir como um importante sistema modelo para o estudo da via de Shh, tráfico ciliar, e vias de diferenciação neuronal. Além disso, a partir de neurónios diferenciados NSC também podem ser utilizadas para ensaios de tráfico ciliar. As neuroesferas são constituídos por aglomerados de células flutuantes resultantes da proliferação de neural células estaminais / progenitoras que crescem na presença de factores de crescimento específicos e superfícies não adesivos 43, 44. As neuroesferas servir como importante em modelos de cultura in vitro para estudar as células estaminais / progenitoras neurais em desenvolvimento normal e doença 31, 45, 46, 47. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em neuroesfera para a cultura de células estaminais / progenitoras neuronais e para a diferenciação em neurónios / glia. Nós particularmente enfatizar o tráfico de sinalização componentes aos cílios de estaminal neuronal / células progenitoras e neurónios diferenciados (Figura 1). Em oposição a cultura de neurónios primários, neuroesferas primárias são relativamente fáceis de cultura, são passíveis de várias passagens e congelamento-descongelamento ciclos, e pode ser submetida a diferenciação em neurónios / glia. Importante, determinou-se que neural derivada-neuroesferaas células estaminais / progenitoras e neurónios diferenciados são ciliadas em cultura e localizar moléculas de sinalização importantes para a função ciliar nestes compartimentos. métodos de cultivo baseadas em Neurosphere pode servir como um sistema modelo ideal para estudar ciliogênese e ciliar tráfico de NSC e neurônios diferenciados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Depois de plaqueamento das células a partir do SVZ em meio NSC durante uma semana, neuroesferas flutuantes foram observados (Figura 2A). Os tamanhos das esferas variou entre 50 e 200 um. Para examinar se as esferas foram derivados a partir de células estaminais / progenitoras neurais, as neuroesferas foram plaqueadas em lamelas e PLL- em meio NSC Laminina-revestido durante 2 dias. Eles foram então imunocoradas em relação ao marcador / células progenitoras estaminai...

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

O cílio primário é fundamentalmente importante na proliferação de células progenitoras neurais, a diferenciação neuronal, e função neuronal adulta. Aqui, descrevemos um método para estudar ciliogênese e o tráfico de proteínas de sinalização para os cílios em células estaminais / progenitoras neuronais e neurónios diferenciados utilizando culturas primárias de neuroesferas.

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

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Biologia do Desenvolvimento

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