Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Выделение Нейросферы из мозга мышей для взрослых <ol><li> Эвтаназии взрослой мыши (около 2 месяцев) от передозировки изофлурана. Дважды проверьте, что мышь перестала дышать и рассекает сразу же после смерти. </li><li> Используя ножницы, сделать срединный разрез, чтобы открыть череп. Удалить ?...

Здесь мы опишем метод для создания и поддержания нейросферы культуры от взрослого СВЗА мыши. Несколько соответствующие моменты, касающиеся культуры заключаются в следующем. Во-первых, размеры сфер, как правило, в пределах от 50 - 200 мкм. По нашему опыту, когда нейросфера получает больше, ч...

Первичная ресничка является микротрубочек на основе динамического субклеточная отсек , который функционирует в качестве сенсорной антенны в координации клеточных сигнальных путей, в том числе Звуковой еж (Тсс) пути во время эмбрионального развития нейронов 1, 2, и на секции субклеточном сигнализации во взрослой нейрональной функции 3, 4 , Сигнальные компоненты этих путей, такие как рецептор Shh исправленного 5; Путь активатора Smoothened (SMO) 6; и Gpr161 7, сирота G-белком рецептор (GPCR) , которые негативно регулирует путь Shh, чтобы локализовать ресничек в динамической моде. Несколько GPCRs сообщалось, локализуется в реснички в нейронах в головном мозге 7, 8, 9, 10 </SUP&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Дефекты ресничек и реснички генерируемых сигнальных путей влияют множественные ткани и все вместе известны как цилиопатии 17, 18, 19. Спектр болезни цилиопатии часто включает в себя психомоторный дефекты, такие как черепно - лицевые аномалии 20, 21, 22. Кроме того, первичные реснички в гипоталамических нейронах регулируют центральные пути сытости, и дефекты приводят к центральному ожирению 23, отражая ожирения у синдромальных цилиопатий , такие как синдром Барды Biedel 24. Кроме того, нейропептид рецепторы сигнализации в ресничках регулируют Centrаль сытость дорожки 11, 14. Цилиарная локализация аденилатциклазы III (ACIII) и GPCR , такие как рецептор соматостатина 3 в нейронах гиппокампа приводит к новым дефектам распознавания объекта и нарушению памяти 25, 26 и параллельна отсутствие целостности цилиарных 27. Аспекты развития ресничек генерируемых сигналов тесно связаны с гомеостазом ткани; в частности, реснички играют важную роль в прогрессировании Тсс-подтипа медуллобластомы , вытекающих из клеток - предшественников гранул в мозжечке 28, 29. Таким образом, первичные реснички играют важную роль в процессе эмбрионального, послеродовом и взрослых нейронов развития и функции. Нейрональные стволовые клетки (NSC,) находятся в субвентрикулярной зоне (SVZ) бокового желудочек, то субгранулярная зона зубчатой ​​извилины гиппокампа, ажелудочковая зона третьего желудочка в гипоталамусе у млекопитающих 30, 31, 32. NSCs мультипотентны, обладают способностью к самообновлению, и имеют важное значение для развития мозга и регенеративной медицины 30. Большинство NSCs в СВЗЕ находится в состоянии покоя и обладает уединенной первичной ресничкой , что во многих случаях проходит к боковому желудочку 33. Первичные сигналы реснички через локализацию различных рецепторов, индуцирующую вниз по течению клеточных реакций, в частности , по отношению к Shh, TGF - beta, и пути киназы рецептора тирозина 2, 34, 35, 36. Так как первичные реснички проходят в боковой желудочек, она выдвинута гипотеза , что первичные реснички обнаружить цитокины в спинномозговой жидкости (CSF) , чтобы активировать NSCs 37 </sвверх&gt;. Недавние исследования показали, что сигнальный путь Тсс и первичные реснички являются критическими для активации стволовых клеток в ремонте и регенерации нескольких тканей, в том числе обонятельного эпителия, легких, почек и 38, 39, 40, 41. Однако механизмы, с помощью которых CSF взаимодействует с NSC, и является ли первичными ресничками участвуют не известны. Прикрепленные NSCs в культуре реснитчатые; локализовать компоненты путей метаболизма SHH, такие как Smo и Gpr161 в ресничках; и Тсс отзывчивым 42. Таким образом, NSC, может служить в качестве важной модельной системы для изучения пути Shh, мерцательной торговли и нейронных путей дифференцировки. Кроме того, нейроны, дифференцированные из NSC, также могут быть использованы для анализов торговли людьми цилиарного. Нейросферы состоят из кластеров свободно плавающих клеток, возникающих из пролиферации neuraл стволовых / клетки - предшественники , которые растут в присутствии специфических факторов роста и неадгезивных поверхностей 43, 44. Нейросферы служат важными в пробирке моделей культуры для изучения нейронных стволовых клеток / клеток - предшественников в нормальном развитии и болезнях 31, 45, 46, 47. Здесь мы описываем анализ нейросфера основе для культивирования нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцировки в нейроны / глии. В частности , мы подчеркиваем торговлю сигнализации компоненты ресничек нервных стволовых / клеток - предшественников и дифференцированных нейронов (рисунок 1). В отличие от культивирования первичных нейронов, первичных нейросферы относительно легко культуры, поддаются множественных пассажей и заморозить-оттаивания циклов, и может проходить дифференциацию в нейроны / глии. Важно отметить, что мы определили, что нейросфера полученных нейронныестволовые клетки / клеток-предшественников и дифференцированные нейроны в культуре мерцательные и локализовать сигнальные молекулы, имеющие отношение к функции цилиарной в этих отсеках. культуральные методы нейросферы основы могут служить в качестве идеальной модели системы для изучения цилиогенезом и цилиарные торговель NSCs и дифференцированных нейронов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

После посева клеток из SVZ в NSC среде в течение недели, плавающие нейросферы наблюдались (фиг.2А). Размеры сфер варьировались от 50 до 200 мкм. Чтобы исследовать, если шарики были получены из нервных стволовых клеток / клеток-предшественников, то нейросферы высевали...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Первичная ресничка принципиально важным в нервной пролиферации клеток-предшественников, дифференцировки нейронов и взрослых функции нейронов. Здесь мы опишем метод для изучения цилиогенеза и торговлей сигнальных белков ресничек в нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцированных нейронов с использованием первичных культур нейросфера.

Использование первичных культур нейросферы для изучения первичных ресничек

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

С помощью<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Вертикальный воздушно-капельных Культуры всей фетальных органов по изучению процессов развития во Mouse органогенеза

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Человек Первичная трофобласта клеточной культуры модель для изучения защитных эффектов мелатонина Против Гипоксия / реоксигенация-индуцированное Срыв

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Перепрограммирование первичной амниотической жидкости и мембраны клеток для плюрипотентности в условиях Xeno бесплатно

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Выделение и характеристика основных крыса клапан интерстициальных клеток: Новая модель для изучения кальцификации клапана аорты

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Культура и Transfection клетки первичной данио рерио

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...