Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolering av Neurosfärer från vuxen mus hjärnans <ol><li> Euthanize en vuxen mus (ca 2 månader gamla) genom en överdos av isofluran. Dubbelkolla att musen har slutat andas och dissekera omedelbart efter döden. </li><li> Med hjälp av en sax, gör en mittlinje snitt att öppna skallen. Ta bort hjärnan. </li><li> Placera hjärnan i kall PBS i en 10 cm skål på is. Följa hela-mount dissektion metod för att erhålla SVZ från den laterala ventrikeln 48. </li><li> Placera den laterala v...

Här beskriver vi en metod för att generera och underhålla neurosfärkulturer från vuxen mus SVZ. Några relevanta punkter om kulturer är som följer. Först, storlekarna hos sfärerna är typiskt mellan 50 - 200 um. Enligt vår erfarenhet, när en neurosfär blir större än 300 nm i diameter, har den optimala tiden för passage missats. Dessa större sfärer innehåller döda celler i kärnan. Andra, såsom neurosfärer används vanligen för att studera neurala stam / ursprungscellerna, är det viktigt att använ...

Den primära cilium är en mikrotubuli baserad dynamisk subcellulär avdelning som fungerar som en sensorisk antenn i koordinerande cellulära signaleringsvägar, inklusive Sonic hedgehog (Shh) -vägen under embryonal neuronal utveckling 1, 2, och compartmentalized subcellulär signalering i vuxen neuronal funktion 3, 4 . Signalering komponenter i dessa reaktionsvägar, såsom Shh receptorn Patched 5; vägen aktivator Smoothened (Smo) 6; och Gpr161 7, en föräldralös G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som reglerar Shh pathway negativt, lokaliseras till cilier på ett dynamiskt sätt. Flera GPCR har rapporterats att lokalisera till flimmerhåren i neuroner i hjärnan 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekter i cilier och cilier genererad signaleringsvägar påverka flera vävnader och är kollektivt kända som ciliopathies 17, 18, 19. Den ciliopathy sjukdom spektrum innefattar ofta nerv defekter, såsom kraniofaciala missbildningar 20, 21, 22. Dessutom primära cilier i hypotalamus neuroner reglera centrala mättnadsvägar, och defekter resulterar i central fetma 23, spegling fetma hos syndrom ciliopathies såsom Bardet Biedel syndrom 24. Dessutom neuropeptid-receptor signalering i cilier reglerar central mättnad vägar 11, 14. Ciliär lokalisering av adenylylcyklas III (ACIII) och GPCR såsom somatostatinreceptor 3 i hippocampusneuroner resultera i nya defekter objektigenkännings och minnesbrister 25, 26 och paralleller en brist på ciliär integritet 27. De utvecklingsmässiga aspekter av cilier genererad signalering är nära knutna till vävnad homeostas; i synnerhet cilier är viktiga för utvecklingen av Shh-subtyp medulloblastom härrör från granulat stamceller i lillhjärnan 28, 29. Således primära cilier spelar en viktig roll under foster, postnatal och vuxna neuronal utveckling och funktion. Neurala stamceller (NSCs) bor i den subventrikulära zonen (SVZ) hos den laterala ventrikeln, den subgranular zonen av gyrus dentatus av hippocampus, ochventrikulära zonen av den tredje ventrikeln i hypotalamus hos däggdjur 30, 31, 32. NSCs är multipotenta, besitter förmåga till självförnyelse och är viktiga för hjärnans utveckling och regenerativ medicin 30. De flesta NSCs i SVZ är vilande och har en ensam primär cilium som i många fall sträcker sig ut till den laterala ventrikeln 33. De primära cilium signaler via lokalisering av olika receptorer, inducerande nedströms cellulära svar, särskilt i förhållande till Shh, TGFp, och receptortyrosinkinaser kinasvägar 2, 34, 35, 36. Eftersom primära cilier sträcker sig in i laterala ventrikeln, är det en hypotes att primära cilier detektera cytokiner i cerebrospinalvätskan (CSF) för att aktivera NSCs 37 </supp&gt;. Nyare studier tyder på att Shh signalväg och primär cilier är kritiska för aktiveringen av stamceller vid reparation och regenerering av multipla vävnader, inkluderande det olfaktoriska epitelet, lunga och njure 38, 39, 40, 41. Men de mekanismer genom vilka CSF kommunicerar med NSCs och huruvida primära cilier är inblandade är inte kända. Vidhäftande NSCs i kultur cilie; lokalisera Shh pathway komponenter, såsom Smo och Gpr161 i cilier; och är Shh reagerar 42. Således kan NSCs tjäna som ett viktigt modellsystem för att studera Shh vägen, ciliär trafficking och neuronal differentiering vägar. Dessutom kan neuroner differentierade från NSCs även användas för ciliär trafficking assayer. Neurosfärer utgörs av kluster av fritt flytande celler som härrör från spridningen av Neural stam / ursprungsceller som växer i närvaro av specifika tillväxtfaktorer och icke vidhäftande ytorna 43, 44. Neuro fungera som viktiga odling in vitro-modeller för att studera neurala stam / progenitorceller i normal utveckling och sjukdomar 31, 45, 46, 47. Här beskriver vi en neurosfär-baserad analys för odling neurala stam / progenitorceller och för differentiering till neuroner / glia. Vi betonar särskilt handeln med signaleringskomponenter till cilier av neurala stam / ursprungsceller och differentierade neuroner (figur 1). I motsats till att odla primära neuroner, primära neurosfärer är relativt lätta att odla, är mottagliga för flera passager och frysnings-upptiningscykler, och kan genomgå differentiering till neuroner / glia. Viktigt har vi bestämt att neurosphere härrör neuralstam / ursprungsceller och differentierade neuroner cilierade i kultur och lokalisera signalmolekyler som är relevanta för ciliär funktion i dessa avdelningar. Neurosfär-baserade odlingsmetoder kan tjäna som en idealisk modell system för att studera ciliogenesis och ciliär handel med NSCs och differentierade neuroner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Efter plätering av cellerna från SVZ i NSC-medium i en vecka, var flytande neurosfärer observerades (Figur 2A). Storlekarna på sfärerna varierade mellan 50 och 200 um. Att undersöka om sfärerna var härledda från neurala stam / ursprungscellerna togs neurosfärerna pläterades på PLL- och Laminin-belagda täckglas i NSC-medium under 2 dagar. De sedan immun mot neurala stam / stamceller markör, nestin. Två dagar behövdes för att låta kulorna att fästa täck...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Den primära cilium är fundamentalt viktig för neural stamcellsproliferation, neuronal differentiering och vuxna neuronal funktion. Här beskriver vi en metod för att studera ciliogenesis och handel med signalproteiner till cilier i neurala stam / ursprungsceller och differentierade neuroner som använder primära neurosfärkulturer.

Använda Primära neurosfärkulturer att studera Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Använda<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright Dropp Kulturer av hela organ hos fostren att studera utvecklingsprocesser under Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Human Primary trofoblasten Cell Culture modell för att studera de skyddande effekterna av Melatonin mot hypoxi / ny syresättning-inducerad Störningar

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering och karakterisering av primära råtta ventil interstitiella celler: en ny modell att studera aortaklaffen förkalkning

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation och odling av primära mänskliga keratinocyter från vuxen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknik för primär mus intestinal Organoider med hjälp av magnetiska nanopartikel Transduction virala vektorer för frysta snittning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion och validering av cellulära åldras i primära mänskliga celler

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En förenklad och effektiv metod att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hudvävnad

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Kultur och Transfection zebrafiskar primära celler

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...