Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Yetişkin Fare Beyninden nöroküreleri 1. İzolasyonu <ol><li> izofluran aşırı dozda tarafından (yaklaşık 2 aylık) bir yetişkin fare Euthanize. Fare nefes durdu ve ölümden sonra hemen teşrih ettiğini tekrar kontrol edin. </li><li> makas kullanarak, kafatası açmak için bir orta hat kesi yapmak. beyin çıkarın. </li><li> Buz üzerinde 10 cm&#39;lik bir tabak içinde soğuk PBS beyin yerleştirin. Lateral ventrikül 48 SVZ&#39;unda elde etmek için tüm montaj diseksiyon yöntemi...

Burada, üretmek ve yetişkin fare SVZ&#39;unda gelen neurosphere kültürleri korumak için bir yöntem açıklanmaktadır. aşağıdaki gibi kültürleri ile ilgili birkaç uygun noktalardır. 200 um - İlk olarak, kürelerin büyüklükleri tipik olarak 50 arasındadır. Bir neurosphere çapı daha büyük 300&#39;den um alır Deneyimlerimize göre,, geçiş için en uygun zaman cevapsız edilmiştir. Bu daha büyük küre çekirdek ölü hücreleri ihtiva etmektedir. Neurospheres yaygın sinir kök / progenitör hü...

Birincil kirpik bir mikrotübül tabanlı dinamik hücre içi bölümü olduğu bir embriyonik nöronal gelişim 1, 2 boyunca sonik kirpi (Shh) yolu da dahil olmak üzere, hücresel sinyal yollarını, koordine duyusal anten ve yetişkin nöronal fonksiyon 3 bölmeli hücre içi sinyal, 4 olarak işlev . Örneğin 5 Patched Shh reseptörü gibi, bu yolların, bileşenleri sinyal; yol aktivatör Smoothened (SMO) 6; ve Gpr161 7, negatif Shh yolu düzenler yetim G-protein kenetli reseptör (GPCR), dinamik bir tarzda cilia lokalize. Çoklu GPCR&#39;ler, 10 beyin 7, 8, 9, nöronlarda kirpikler lokalize bildirilmiştir </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Kirpikler ve kirpikler tarafından oluşturulan sinyal geçiş yollarında bazı kusurların çoklu dokuları etkiler ve birlikte ciliopathies 17, 18, 19 olarak bilinir. Ciliopathy hastalık spektrumu sıklıkla kraniofasial anormallikler 20, 21, 22 olarak nöro kusurları içerir. Buna ek olarak, hipotalamus nöronları birincil kirpikler merkezi tokluk yolları düzenler ve kusurları gibi Bardet Biedel sendromu 24 olarak sendrom ciliopathies şişmanlığın yansıtma, merkezi şişmanlık 23 ile sonuçlanır. Buna ek olarak, kirpikler sinyalleşme, nöropeptit alıcı centr düzenlerark tokluk 14, 11 geçiş yolu. Bu tür hipokampal nöronlar somatostatin reseptör 3 olarak adenilat siklaz III (ACIII) ve GPCR&#39;lerin Siliyer lokalizasyonu yeni nesne tanıma kusurları ve 25, 26 hafıza noksanlıkları neden olur ve siliyer bütünlüğü 27 bir zamanda gelişmiştir. kirpikler tarafından oluşturulan sinyal gelişimsel açıdan yakın bir doku homeostazında bağlanırlar; Özellikle, sil serebellum 28, 29 granül progenitörlerinden kaynaklanan Shh alt tip medulloblastoma ilerlemesi için önemlidir. Böylece, birincil kirpikler embriyonik, postnatal ve erişkin nöronal gelişim ve işlevi sırasında önemli roller oynarlar. Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) subventriküler bölgede lateral ventrikül (SVZ), hipokampusun dentat girus subgranuler kısmında ve ikametmemelilerde 30, 31, 32&#39;de hipotalamusta üçüncü ventrikül ventriküler bölgesi. NSC&#39;lerde multipotent olan kendini yenileme kapasitesini sahiptir ve beyin gelişimi ve rejeneratif tıpta 30 için önemlidir. SVZ&#39;una en NSC&#39;lerde hareketsiz olan ve, birçok durumda, yan karıncık 33 dışarı uzanan bir tek birinci cilium sahiptirler. Özellikle Shh, TGFp, ve reseptör tirozin kinaz yollarında 2, 34, 35, 36 ile ilgili olarak, alt-hücresel tepkiler oluşturmada farklı reseptörlerinin lokalizasyonu, yoluyla birincil kirpik sinyaller. Birincil kirpikler yanal ventrikil içine uzanan yana, birincil kirpikler beyin-omurilik sıvısı (CSF) NSCs 37 aktif hale getirmek için sitokinleri tespit olduğu hipotezi </s&gt; Yukarı. Son çalışmalar, Shh sinyal yolu ve birinci kirpikler koku epiteli, akciğer ve böbrek 38, 39, 40, 41 dahil olmak üzere birçok dokuda, tamir kök hücrelerin aktivasyonu ve rejenerasyonu için önemli olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, CSF mekanizma NSC&#39;lerde ile iletişim kurar ve ana kirpikler olup bilinmemektedir katılmaktadırlar. kültür içinde yapışık NSC&#39;lerde kirpikli edilir; Bu tür siliyalarda Smo&#39;nun ve Gpr161 olarak Shh yolu bileşenlerinin, lokalize; ve 42 tepkili Sus bulunmaktadır. Bu nedenle, NSC&#39;lerde bir Shh yolu incelemek için önemli model sistemi, siliyer ticareti ve nöronal farklılaşma yol olarak hizmet edebilir. Buna ek olarak, NSC&#39;lerde ayırt nöronları da siliyer trafik deneyleri için de kullanılabilir. Neurospheres neura çoğalması kaynaklanan serbest yüzen hücre kümeleri oluşturulurspesifik büyüme faktörleri ve yapışkan olmayan yüzeylerin 43, 44 varlığında büyüme l kök / progenitör hücreler. Neurospheres normal gelişimi ve hastalığın 31, 45, 46, 47 nöral kök / progenitör hücreleri incelemek için in vitro kültür modellerinde önemli vermektedir. Burada, nöral kök / progenitör hücrelerin kültürlenmesi için ve sinir / glia içine farklılaşması için bir neurosphere bazlı analiz tarif eder. Özellikle nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların (Şekil 1) tüycüklere bileşenleri sinyal kaçakçılığı vurgulamaktadır. birincil nöronları kültür aksine, birinci Neurospheres, kültür nispeten kolay birden fazla geçit için uygun olan ve donma-erime döngüleri ve sinir / glia farklılaşmayı geçirebilmektedir. Daha da önemlisi, bu neurosphere türetilmiş nöral tespitkök / progenitör hücreleri ve farklılaşmış nöronların kültür içinde kirpikli ve bu bölmelerin siliyer fonksiyonu ile ilgili sinyal molekülleri yerini belirleyen. Neurosphere tabanlı kültürleme metotları NSC&#39;lerde ve farklılaşmış nöronların ciliogenesis ve siliyer kaçakçılığı çalışmak için ideal bir model sistem olarak hizmet edebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Bir hafta MGK ortamında SVZ&#39;unda hücreleri kaplama sonra, yüzer Neurospheres (Şekil 2A) gözlenmiştir. kürelerin büyüklükleri 50 ila 200 um arasında değişmektedir. Küreler nöral kök / progenitör hücreler elde edilmiştir olmadığını belirlemek için Neurospheres PLL- ve üzerine plakalanmıştır 2 gün MGK orta lamelleri laminin kaplı. Daha sonra nöral kök / progenitör hücre işaretleyici, Nestin karşı boyama yapıldı. İki gün küreler ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Birincil kirpik nöral projenitör hücre proliferasyonu, nöronal farklılaşma ve yetişkin nöronal fonksiyon temelde önemlidir. Burada, ciliogenesis ve primer neurosphere kültürleri kullanılarak nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların cilia proteinlerin sinyal kaçakçılığı incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...