Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Vi takker AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Dette arbejde blev økonomisk støttet af AGL201568330-C2-1-R projektet (MINECO/FEDER). David G. Valcarce blev finansieret af Junta de Castilla y León (EDU1084-2012) og Fondo sociale Europeo. Forfatterne anerkender Dr. Ana Riaza og Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero og José Ramón Guiérrez. Vi takker også Paula Fernández Colado for videography.

Bemærk: Fluorokrom inkubation og konfokal analyse vil tage mindst 2-3 h for et kontrolelement og en behandlede prøve. Databehandling er ikke inkluderet i denne beregning. Påkrævede materialer kan findes i Tabel af materialer. Denne protokol kan anvendes til at friske eller befrugtede sædcellerne. Solea senegalensis er en fiskearter, der gyder i koldt vand, arbejde altid under kolde betingelser (4-7 ° C). Se figur 1 for en generel opfattelse af protokollen....

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

Det er velkendt, at mitokondrier er centrale organelles for sperm motilitet og funktion. Disse organeller er samtidigt direkte involveret i ROS produktion. Interessant, er kontrolleret niveauer af ROS nødvendige for korrekt sperm funktion1. Positive relationer mellem frugtbarhed og oxidativ stress har været vist i pattedyr11 men overdreven niveauer påvirker sperm kvalitet12. En afgørende faktor, der kunne være afgørende hen imod en positiv elle...

Reaktive ilt arter produktion har været forbundet med sædkvaliteten seneste1. Selv om ROS produktion i mitokondrier kan betragtes som en normal fysiologisk proces, er oxidativ stress af et overskud af ROS produktion en klar årsag til skader i sædcellerne på forskellige niveauer. Hos mennesker er oxidativ stress forbundet med mandlig infertilitet, ændre motilitet og evnen til at gennemgå retsevne2; hos pattedyr, er ændring af DNA integritet i frossen sæd prøver også relateret til syntese af H2O23.
Kryopræservering er en fælles teknik til gen Bank inden for akvakulturen. Denne teknologi er særligt vigtigt i arter med reproduktive problemer såsom Solea senegalensis. Denne værdifulde arter på markedet viser reproduktiv dysfunktion i individer født i fangenskab på grund af mangel på frieri. Dette faktum gør sperm kryopræservering nødvendigt at have sæd tilgængelighed for kunstig befrugtning. Men kryopræservering kunne være en kilde til oxidativ stress, som kunne være til skade for sædcellerne4 som studier har rapporteret en gavnlig effekt af antioxidant-tilskud. ROS hæmning gennem mitokondrie-målrettet antioxidant var efter sigende gavnligt for sperm kryopræservering i gul havkat5.
Niveauer af ROS i sæd prøver er derfor vigtigt at kende, især efter kryopræservering6,7 fordi disse molekyler er blevet anerkendt som en ulempe for sperm overlevelse og frugtbarhed8. Derudover kunne studerer fordeling af ROS i cellen være afgørende at udlede potentielle skadens. Som et eksempel, lave niveauer af ROS i mitokondrierne kunne antages normalt og kompatibel med sperm funktion, men høje niveauer af ROS i kernen kan være indikatorer for sædcellerne DNA skader. H2O2 er en af de mest relevante ROS, der kunne blive frigivet fra mitokondrierne og trænge ind til kernen, fordi det er et lille og gratis-mindre molekyle9. Dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kan netop afsløre intracellulære peroxid udsender grønne fluorescens. I denne artikel præsenteres en detaljeret protokol til påvisning af H2O2 intracellulære lokalisering i Solea senegalensis sæd benytter Konfokal mikroskopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

Oxidativt stress er en af de vigtige faktorer i faldende sædkvalitet. Udvikle effektive protokoller til påvisning af reaktive ilt arter (ROS) i sædcellerne er af stor betydning i alle arter, men disse metoder er sjældent anvendte og endnu mindre i teleost. Kryopræservering er en nyttig teknik i akvakultur til forskellige formål, herunder gen bank og garanteret sperm tilgængelighed hele året. Frysning/optøning procedurer kunne forårsage ROS produktion og ødelægge sædcellerne. I betragtning af de potentielle skader der kunne et overskud af ROS produktion forårsage i sædcellerne afhængigt af deres lokalisering, her en detaljeret metode til at registrere H2O2 og evaluere sin intracellulære lokalisering af konfokalmikroskopi er fastsat. Til dette formål, en kombination af 3 fluorokromer (2′, 7 '-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), en levende mitokondrier pletten og 4′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI)) bruges til at evaluere fælles lokalisering af H2O2 med sædcellerne kerner eller mitokondrier i Solea senegalesis sperm prøver.

Konfokal mikroskopi er en ideel metode til evaluering af intracellulær ROS i teleost sperm. Kombinationen af de tre fluorokromer (DAPI, mitokondrier pletten og DCFH-DA) præsenteres i denne undersøgelse (figur 1) indeholder mange nyttige oplysninger, der kan anvendes i grundlæggende forskning og kan have programmer for at forbedre procedurer, der anvendes i industrielle akvakultur planter, såsom kryopræservering protokoller. Forskellige typer af analyse ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Denne protokol beskriver en detaljeret metode til påvisning af H2O2 lokalisering inden for Solea senegalensis sædcellerne ved hjælp af en følsom fluorokrom DCFH-DA for ROS, en levende mitokondrier pletten for mitokondrier og DAPI for kerner visualisering, henholdsvis. Protokollen er designet til at blive udført inden for 2 h med enten friske eller optøede sædcellerne.

Evaluering af intracellulær placering af reaktive ilt arter i Solea Senegalensis sædcellerne

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Øresvinet delfiner (Tursiops truncatus) sædcellerne: indsamling, kryopræservering og heterolog In Vitro fertilisering

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

En kvantitativ måling af reaktive ilt arter og gulne-associerede sekretoriske fænotype i normale humane fibroblaster under onkogen-induceret gulne

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Konfokal Live Imaging af skyde apikale ildens fra forskellige plantearter

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluering af gødskning tilstand ved at spore sperm nuklear morfologi i Arabidopsis dobbelt befrugtning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...