Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Wij danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Dit werk werd financieel ondersteund door AGL201568330 + C2 + 1 + R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce werd gefinancierd door de Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) en Fondo sociale Europeo. Auteurs erkennen Dr. Ana Riaza en Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero en José Ramón Guiérrez. Wij danken ook Paula Fernández Colado voor videografie.

Opmerking: Fluorescerende incubatie en confocal analyse zal duren ten minste 2-3 uur voor een besturingselement en een behandelde monster. Verwerking van gegevens is niet opgenomen in de berekening van deze tijd. Benodigde materialen kunnen worden gevonden in de Tabel van materialen. Dit protocol kan worden toegepast op vers of cryopreserved spermacellen. Solea senegalensis is een vissoort die in koud water, werk altijd onder koude omstandigheden (4-7 ° C paait). Zie afbeel...

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

Het is algemeen bekend dat mitochondriën belangrijke organellen voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en functie zijn. Deze organellen zijn gelijktijdig direct betrokken bij de productie van ROS. Interessant, zijn gecontroleerde niveaus van ROS nodig voor goede zaadcellen functie1. Positieve relaties tussen vruchtbaarheid en oxidatieve stress zijn aangetoond in zoogdieren11 maar buitensporige niveaus beïnvloeden sperma kwaliteit12. Een cruciale ...

De productie van reactieve zuurstof soorten is in verband gebracht met de kwaliteit van het sperma onlangs1. Hoewel ROS productie in mitochondriën kan worden beschouwd als een normale fysiologische proces, is oxidatieve stress door een overmaat aan ROS productie een duidelijke oorzaak van de schade in spermacellen op verschillende niveaus. Bij de mens wordt oxidatieve stress geassocieerd met mannelijke infertiliteit, wijzigen van de beweeglijkheid en de mogelijkheid om het ondergaan van de rechtsbevoegdheid2; bij zoogdieren, heeft verandering van DNA integriteit in ingevroren sperma monsters ook verband met de synthese van H2O23.
Cryopreservatie is een gemeenschappelijke techniek voor gen bankbedrijf in de aquacultuur. Deze technologie is met name belangrijk in soorten met vruchtbaarheidsproblemen zoals Solea senegalensis. Deze waardevolle soorten op de markt toont reproductieve dysfunctie in individuen geboren in gevangenschap als gevolg van een gebrek aan verkering. Dit feit maakt sperma cryopreservatie noodzakelijk dat sperma beschikbaarheid voor kunstmatige bevruchting. Cryopreservatie zou echter een bron van oxidatieve stress die schadelijk voor spermacellen4 zou kunnen zijn, zoals studies hebben een gunstig effect van antioxidant suppletie gemeld. ROS remming door middel van mitochondriale-gerichte antioxidant was naar verluidt gunstig voor sperma cryopreservatie in gele meerval5.
De niveaus van ROS in spermastaaltje zijn daarom belangrijk om te weten, vooral na cryopreservatie6,7 , omdat deze moleculen zijn erkend als een nadeel voor zaadcellen overleven en vruchtbaarheid8. Bovendien, het bestuderen van de verdeling van de ROS binnen de cel kan doorslaggevend zijn voor afleiden van het niveau van de potentiële schade. Als voorbeeld, lage niveaus van ROS in de mitochondriën kunnen worden aangenomen, normale en compatibel met sperma functie, maar hoge niveaus van ROS binnen de kern zou indicatoren van de schade van DNA van spermacellen. H2O2 is een van de meest relevante ROS die kunnen vrijkomen uit de mitochondriën en het doordringen van de kern, want het is een kleine en lading-minder molecuul9. Dichlorofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA) kan specifiek intracellulaire peroxide uitstoten groene fluorescentie onthullen. In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het opsporen van H2O2 intracellulaire lokalisatie in Solea senegalensis sperma met behulp van de confocal microscopie gepresenteerd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

Oxidatieve stress is één van de belangrijkste factoren in het verminderen van de kwaliteit van het sperma. Het ontwikkelen van efficiënte protocollen voor het opsporen van reactieve zuurstof soorten (ROS) in spermacellen is van groot belang in alle soorten, maar deze methoden zijn zelden gebruikte en nog minder in teleost. Cryopreservatie is een nuttige techniek in de aquacultuur voor verschillende doeleinden, met inbegrip van gene bancaire en gegarandeerde sperma beschikbaarheid gedurende het hele jaar. Invriezen/ontdooien procedures kunnen veroorzaken ROS productie en schadelijk voor de zaadcellen. Gezien de potentiële die schade zou kunnen een overmaat van ROS productie veroorzaken bij spermacellen afhankelijk van hun lokalisatie, hier een gedetailleerde methodologie te detecteren H2O2 en te evalueren van de intracellulaire lokalisatie door confocale microscopie wordt verstrekt. Voor dit doel, een combinatie van 3 fluorochromes (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA), een live mitochondriën vlek en 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI)) worden gebruikt om te evalueren van de co lokalisatie van H2O2 met spermacellen kernen of mitochondriën in Solea senegalesis spermastaaltje.

Confocale microscopie is een ideale methode voor intracellulaire ROS beoordeling in teleost sperma. De combinatie van de drie fluorochromes (DAPI mitochondriën vlek en een DCFH-DA) gepresenteerd in deze studie (Figuur 1) biedt veel nuttige informatie die kan worden toegepast bij het basisonderzoek en kan hebben toepassingen in de verbetering van de methoden die worden toegepast in industriële aquacultuur planten, zoals cryopreservatie protocollen. Verschill...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het opsporen van H2O2 localisatie binnen Solea senegalensis spermacellen met behulp van een gevoelige fluorescerende DCFH-DA ROS, een levende mitochondriën vlek voor mitochondria en DAPI voor kernen visualisatie, respectievelijk. Het protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd binnen de 2 uur met verse of ontdooide spermacellen.

Evaluatie van intracellulaire locatie van reactieve zuurstof soorten in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose dolfijn (Tursiops truncatus) Spermatozoa: collectie, cryopreservatie en heterologe In Vitro bevruchting

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Confocale Live beeldvorming van Shoot apicale Meristems van verschillende plantensoorten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...