Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Wir danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Diese Arbeit wurde von AGL201568330-C2-1-R-Projekt (MINECO/FEDER) finanziell unterstützt. David G. Valcarce wurde finanziert durch die Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) und Fondo soziale Europeo. Autoren anerkennen Dr. Ana Riaza und Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero und José Ramón Guiérrez. Wir danken auch Paula Fernández Colado für Videografie.

Hinweis: Fluorochrom Inkubation und konfokale Analyse dauert mindestens 2-3 h für ein Steuerelement und einer behandelten Probe. Datenverarbeitung ist in dieser Berechnung nicht enthalten. Benötigten Materialien finden Sie in der Tabelle der Materialien. Dieses Protokoll kann auf frische oder kryokonservierten Samenzellen angewendet werden. Solea Senegalensis ist eine Fischart, die in kaltem Wasser, arbeiten immer unter kalten Bedingungen (4-7 ° C) laicht. Siehe Abbildung...

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	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. 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Es ist bekannt, dass Mitochondrien wichtigen Organellen für die Beweglichkeit der Spermien und Funktion sind. Diese Organellen sind gleichzeitig direkt an ROS-Produktion beteiligt. Interessanterweise sind kontrollierte ROS für richtige Sperma Funktion1benötigt. Positive Beziehungen zwischen Fruchtbarkeit und oxidativen Stress sind Säugetiere11 erwiesen, aber übermäßigen Niveaus beeinflussen Spermien Qualität12. Ein entscheidender Faktor, die ...

Reaktive Sauerstoff-Spezies-Produktion mit Spermienqualität verknüpft wurde vor kurzem1. ROS-Produktion in den Mitochondrien einen normalen physiologischen Prozess betrachtet werden kann, zwar oxidativer Stress durch ein Übermaß an ROS-Produktion eine klare Ursache des Schadens in Spermien auf verschiedenen Ebenen. Beim Menschen ist oxidativer Stress zugeordnet männliche Unfruchtbarkeit, Motilität und die Fähigkeit zur Rechtsfähigkeit2unterziehen zu verändern; bei Säugetieren ist Veränderung der DNA-Integrität in Tiefgefriersperma Proben auch zur Synthese von H2O23verbunden.
Kryokonservierung ist ein gängiges Verfahren für gen-banking in der Aquakultur. Diese Technologie ist besonders wichtig bei Arten mit reproduktiven Problemen wie Solea Senegalensis. Dieses wertvollen Arten auf dem Markt zeigt reproduktiven Dysfunktion bei Personen, die in Gefangenschaft aufgrund mangelnder Balz geboren. Diese Tatsache macht die Kryokonservierung von Spermien Spermien Verfügbarkeit für künstliche Befruchtung erforderlich. Jedoch könnte die Kryokonservierung eine Quelle von oxidativem Stress, die schädlich für Spermien4 sein könnte, wie Studien eine positive Wirkung von antioxidativen Supplementierung berichtet haben. ROS-Hemmung durch mitochondriale gezielte antioxidative war angeblich vorteilhaft für die Kryokonservierung von Spermien in gelbe Wels5.
Daher sind die Konzentrationen von ROS in Spermaproben wichtig zu wissen, vor allem nach Kryokonservierung6,7 , weil diese Moleküle als ein Nachteil für das Überleben der Spermien und Fruchtbarkeit8erkannt worden sind. Darüber hinaus könnte lernen die Verteilung von ROS innerhalb der Zelle entscheidend für die Höhe des potenziellen Schadens ableiten. Als Beispiel könnte niedrigen Niveau von ROS in den Mitochondrien können davon ausgegangen werden, normal und mit Spermienfunktion kompatibel, aber hohe Konzentrationen von ROS im Zellkern Indikatoren der Spermien-DNA-Schäden. H2O2 ist eines der wichtigsten ROS, die von den Mitochondrien freigesetzt werden könnten und den Kern zu durchdringen, denn es ist eine kleine und weniger Ladung-Molekül-9. Dichlorofluoresceins Diacetat (RLKV-DA) kann insbesondere intrazelluläre Peroxid emittierenden grünen Fluoreszenz zeigen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Erfassung von H2O2 intrazelluläre Lokalisation in Solea Senegalensis Spermien mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

Oxidativer Stress ist einer der wichtigsten Faktoren in abnehmender Qualität der Spermien. Entwicklung von effizienten Protokolle zur Erkennung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Spermien ist von großer Bedeutung in irgendeiner Sorte, aber diese Methoden sind selten genutzte und noch weniger in teleost. Kryokonservierung ist eine nützliche Technik in der Aquakultur für verschiedene Zwecke, einschließlich gen Banking und garantierte Verfügbarkeit der Spermien im Laufe des Jahres. Einfrieren/Auftauen Verfahren könnte dazu führen, dass ROS-Produktion und schädigen die Spermien. Bedenkt, dass die potenziellen Schäden kann ein Übermaß an ROS-Produktion in Spermien je nach ihrer Lokalisation, hier eine detaillierte Methode, H2O2 erkennen und bewerten die intrazelluläre Lokalisation durch konfokale Mikroskopie führen steht zur Verfügung. Zu diesem Zweck eine Kombination von 3 Fluorochromes (2, 7-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV-DA), ein live Mitochondrien Fleck und 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)) werden verwendet, um die Co Lokalisierung von H2O 2bewerten mit Samenzellen Kerne oder Mitochondrien in Solea Senegalesis Spermaproben.

Konfokale Mikroskopie ist eine ideale Methode zur intrazellulären ROS-Auswertung in teleost Spermien. Die Kombination der drei Fluorochromes (DAPI, Mitochondrien Fleck und RLKV-DA) präsentiert in dieser Studie (Abbildung 1) bietet viele nützliche Informationen, die in der Grundlagenforschung aufgebracht werden kann und kann Anwendungen bei der Verbesserung von Verfahren, die in industrielle Aquakultur Anlagen, z. B. Kryokonservierung Protokolle. Verschiede...

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Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Erkennung von H2O2 Lokalisierung innerhalb Solea Senegalensis Spermien mit einem sensiblen Fluorochrom RLKV-DA für ROS, ein Leben Mitochondrien Fleck für Mitochondrien und DAPI für Kerne Visualisierung, beziehungsweise. Das Protokoll soll innerhalb von 2 h mit frischen oder aufgetauten Spermien durchgeführt werden.

Bewertung der intrazellulären Lage von reaktiven Sauerstoffspezies in Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

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Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

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Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

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Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

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Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

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Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...