Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

אנו מודים AQUAGAMETE פא 1205 עלות פעולה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט AGL201568330-C2-1-R (MINECO/פדר). דוד ג Valcarce מומן על ידי דה חונטה ולאון (EDU1084 2012) ו Fondo Europeo חברתית. מחברים מכיר ד ר אנה Riaza, האנרגטי לים חווה דרום אמריקה, ד ר פאולין דה פז, ד ר איגנסיו מרטינס מונטרו, חוסה רמון Guiérrez. אנו מודים גם פאולה פרננדז Colado עבור צילום וידאו.

הערה: דגירה Fluorochrome וניתוח קונאפוקלית ייקח לפחות 2-3 h עבור פקד, מדגם שטופלו. חישוב זמן זה אינו כולל עיבוד נתונים. חומרים הדרושים ניתן למצוא את הטבלה של חומרים. פרוטוקול זה ניתן ליישם טריים או cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis הוא מין דג שמשריץ במים קרים, עבודה תמיד בתנאים קרים (4-7 ° C). ראה <...

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

זה ידוע כי המיטוכונדריה הם organelles מפתח עבור זרע תנועתיות ותפקוד. Organelles אלה מעורבים במקביל ישירות בייצור ROS. מעניין, רמות מבוקרת של ROS נדרשים עבור זרע תקין פונקציה1. יחסים חיוביים בין פוריות סטרס חמצוני הוכחו יונקים11 אך רמות מוגזמות להשפיע על איכות הזרע12</sup...

ההפקה של מינים חמצן תגובתי נקשרה עם איכות זרע לאחרונה1. למרות ROS הייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיחשב תהליך פיזיולוגי נורמלי, סטרס חמצוני על-ידי עודף הייצור ROS הוא סיבה ברורה של פגיעה ב spermatozoa ברמות שונות. בבני אדם, סטרס חמצוני מזוהה עם בעיות פוריות הגבר, שינוי תנועתיות ואת היכולת לעבור capacitation2; ביונקים, שינוי של שלמות הדנ א דגימות זרע קפוא גם קשורה סינתזה של H-2O-2-3.
הקפאה קריוגנית היא טכניקה נפוצה עבור ג'ין בנקאות, חקלאות ימית. טכנולוגיה זו חשוב במיוחד במינים עם בעיות הרבייה כגון Solea senegalensis. מין זה יקר בשוק מראה תפקוד הרבייה אצל אנשים נולדו בשבי עקב מחסור של חיזור. עובדה זו הופכת את הזרע הקפאה קריוגנית חייב להיות זמינות הזרע להפריה מלאכותית. עם זאת, הקפאה קריוגנית יכול להיות מקור של סטרס חמצוני זה יכול להיות מזיקה spermatozoa4 כמו מחקרים דיווחו על השפעה מיטיבה של תוספי נוגדי חמצון. ROS עיכוב באמצעות נוגדי חמצון מיטוכונדריאלי במיקוד היה מועיל הדיווחים על הקפאה קריוגנית זרע שפמנון צהוב5.
לכן, הרמות של ROS דגימות זרע חשובים לדעת, במיוחד לאחר הקפאה קריוגנית6,7 כי מולקולות אלה הוכרו חיסרון זרע הישרדות, פוריות8. יתר על כן, לומד את ההפצה של ROS בתוך התא יכול להיות מכריע להסיק שרמת נזק פוטנציאלי. לדוגמה, רמות נמוכות של ROS בתוך המיטוכונדריה יכול להניח נורמלי ולא תואם עם פונקציית זרע, אך רמות גבוהות של ROS בתוך הגרעין יכול להיות סממנים של נזק לדנ א spermatozoa. H2O2 הוא אחד האבחון הרלוונטיים ביותר יכול להשתחרר מן המיטוכונדריה, לחדור לגרעין כי הוא מולקולה קטנה, תשלום-פחות9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) באופן ספציפי יכול לחשוף מי חמצן תאיים פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק. במאמר זה, מוצג עבור מזהה H2O2 לוקליזציה תאיים Solea senegalensis הזרע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול מפורט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

סטרס חמצוני הוא אחד הגורמים החשובים בהפחתת באיכות הזרע. פיתוח פרוטוקולי יעיל לגילוי מינים חמצן תגובתי (ROS) ב- spermatozoa היא בעלת חשיבות גבוהה בכל מין, אך שיטות אלה הן נדירות אפילו פחות teleost. הקפאה קריוגנית היא טכניקה שימושית בחקלאות ימית למטרות שונות, לרבות בנקאות ג'ין והבטיחה את הזרע זמינות לאורך כל השנה. הקפאה \ הפשרה הליכים יכול לגרום ROS הייצור, נזק לתאי הזרע. בהתחשב פוטנציאליים נזק זה עודף של ROS הפקה עלול לגרום ב spermatozoa תלוי לוקליזציה שלהם, הנה מתודולוגיה מפורט כדי לזהות2O H2 וכן להעריך שלה לוקליזציה תאיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסופק. למטרה זו, שילוב של 3 fluorochromes (2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), כתם המיטוכונדריה בשידור חי ו- 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)) משמשים להערכת ההתאמה שיתוף של H2O2 עם spermatozoa גרעינים או המיטוכונדריה דגימות זרע Solea senegalesis .

מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטה אידיאלית להערכה ROS תאיים זרע teleost. השילוב של שלוש fluorochromes (דאפי, הכתם המיטוכונדריה, DCFH-DA) שהוצגו במחקר זה (איור 1) מספק הרבה מידע שימושי, זה יכול להיות מיושם במחקר בסיסי ויש יישומים לשיפור תהליכי בשימוש חקלאות מים תעשייתי צמחים,...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורט לגילוי H2O2 לוקליזציה בתוך Solea senegalensis spermatozoa באמצעות fluorochrome רגיש DCFH-DA ROS, כתם המיטוכונדריה בשידור חי עבור המיטוכונדריה, דאפי עבור גרעינים ויזואליזציה, בהתאמה. הפרוטוקול נועד להתבצע בתוך 2 h עם spermatozoa טריים או המופשרים.

הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו Heterologous הפריה

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

מדידה כמותית של מינים חמצן תגובתי, הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה ב Fibroblasts אנושי נורמלי במהלך אונקוגן-induced הזדקנות ביולוגית

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...