Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Vi takker AQUAGAMETE FA 1205 pris handling. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av AGL201568330-C2-1-R prosjektet (MINECO/FEDER). David G. Valcarce ble finansiert av Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) og Fondo sosiale Europeo. Forfatterne bekrefter Dr. Ana Riaza og Stolt havet Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero og José Ramón Guiérrez. Vi takker også Paula Fernández Colado for videography.

Merk: Fluorochrome inkubasjon og AC confocal analyse vil ta minst 2-3 h for en kontroll og en behandlet prøve. Behandling er ikke inkludert i denne beregning. Nødvendig materiale kan finnes i Tabell for materiale. Denne protokollen kan brukes friske eller cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis er en fiskeart som gyter i kaldt vann, arbeid alltid under kalde forhold (4-7 ° C). Se figur 1 for en oversikt over protokollen.
1. forarbe...

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

Det er velkjent at mitokondrier er viktige organelles for Spermiemotilitet og funksjon. Disse organeller er samtidig direkte involvert i ROS produksjon. Interessant, er kontrollert nivåer av ROS nødvendig for riktig sæd funksjon1. Positive relasjoner mellom fruktbarhet og oksidativt stress har blitt vist i pattedyr11 men overdreven nivåer påvirke sperm kvalitet12. En viktig faktor som kunne være avgjørende mot en positiv eller negativ effekt e...

Reaktive oksygen arter produksjon har vært knyttet til kvaliteten nylig1. Selv om ROS produksjon i mitokondrier kan betraktes som en normal fysiologisk prosess, er oksidativt stress av et overskudd av ROS produksjon en klar årsak til skader i spermatozoa på ulike nivåer. Hos mennesker er oksidativt stress knyttet til mannlig infertilitet, endre motilitet og muligheten til å gjennomgå capacitation2; i pattedyr, har endring av DNA integritet i frossen sæd prøver også vært knyttet til syntese H2O23.
Kryonisk bevaring er en vanlig teknikk for genet i akvakultur. Denne teknologien er spesielt viktig i arter med reproduktive problemer som Solea senegalensis. Dette verdifulle arter i markedet viser reproduktive dysfunksjon i individer født i fangenskap skyldes manglende frieri. Dette faktum gjør sperm kryonisk bevaring må sperm tilgjengelighet for kunstig befruktning. Imidlertid kan kryonisk bevaring være en kilde til oksidativt stress som kan være skadelig for spermatozoa4 som studier har rapportert en gunstig effekt av antioksidant kosttilskudd. ROS hemming gjennom mitokondrie målrettede antioksidant var angivelig gunstig for sæden kryonisk bevaring i gul steinbit5.
Nivåene av ROS i sperm prøver er derfor viktig å vite, særlig etter kryonisk bevaring6,7 fordi disse molekylene har vært anerkjent som en ulempe for sperm overlevelse og fruktbarhet8. Videre kan studerer fordelingen av ROS i cellen være avgjørende å antyde hvilket skader. Som et eksempel, lave nivåer av ROS i mitokondrier kan antas normal og kompatibel med sperm funksjonen, men høye nivåer av ROS i kjernen kan være indikatorer spermatozoa DNA skade. H2O2 er en av de mest relevante ROS som kan frigis fra mitokondrier og trenge kjernen fordi det er en liten og gratis mindre molekyl9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) kan spesielt avsløre intracellulær peroxide emitting grønne fluorescens. En detaljert protokoll for å oppdage H2O2 intracellulær lokalisering i Solea senegalensis sæden med AC confocal mikroskopi er presentert i denne artikkelen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

Oksidativt stress er en av de viktige faktorene i å redusere kvaliteten. Utvikle effektiv protokoller for å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) i spermatozoa er av høy betydning noen arter, men disse metodene er sjelden brukt, og enda mindre i teleoster. Kryonisk bevaring er en nyttig teknikk i akvakultur for ulike formål, herunder genet bank og garantert sperm tilgjengelighet gjennom hele året. Frysing/tining prosedyrer kan forårsake ROS produksjon og skade sædceller. Vurderer den potensielle skade som kan et overskudd av ROS produksjon forårsake i spermatozoa avhengig av deres lokalisering, her en detaljert metode til å gjenkjenne H2O2 og evaluere sin intracellulær lokalisering av AC confocal mikroskopi tilbys. For dette formålet, en kombinasjon av 3 fluorochromes (2 ', 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), en live mitokondrier flekk og 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) brukes til å evaluere den co lokaliseringen av H2O2 med spermatozoa kjerner eller mitokondrier i Solea senegalesis sperm prøver.

AC confocal mikroskopi er en ideell måte intracellulær ROS evaluering i teleost sperm. Kombinasjonen av de tre fluorochromes (DAPI, mitokondrier flekken og DCFH-DA) presenteres i denne studien (figur 1) gir mange nyttige opplysninger som kan brukes i grunnforskning og kan ha programmer i å forbedre prosedyrer brukes i industriell oppdrett planter, for eksempel kryonisk bevaring protokoller. Ulike typer analyse kan gjennomføres for å koordinere intracellu...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Denne protokollen beskriver en detaljert metodikk for å oppdage H2O2 lokalisering i Solea senegalensis spermatozoa bruker en følsom fluorochrome DCFH-DA for ROS, en live mitokondrier flekk for mitokondrier og DAPI for kjerner visualisering, henholdsvis. Protokollen er utformet som skal utføres innen 2 timer med enten friske eller tinte spermatozoa.

Evaluering av intracellulær plasseringen av reaktive oksygen arter i Solea Senegalensis Spermatozoa

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin (bred snute truncatus) Spermatozoa: innsamling, kryonisk bevaring og Heterologous I Vitro fertilisering

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder for Imaging intracellulær pH i hårsekken stamcelleforskningen slektslinje i Live Drosophila Ovarian vev

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

En kvantitativ måling av reaktive oksygen arter og Senescence-assosiert sekretoriske fenotypen i Normal menneskelig fibroblaster under folkemengde

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

AC confocal Live bildebehandling av skyte apikal Meristems fra forskjellige plantearter

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluering av befruktning stat ved tracing sperm kjernefysisk morfologi i Arabidopsis dobbel befruktning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...