Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 custo de ação. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce foi financiado pela Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo Social Europeo. Os autores reconhecem a Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Agradecemos também a Paula Fernández Colado pela videografia.

Nota: Incubação fluorocromo e confocal análise levará pelo menos 2-3 h para um controle e uma amostra tratada. Processamento de dados não está incluído no cálculo deste tempo. Os materiais necessários podem ser encontrados na Tabela de materiais. Este protocolo pode ser aplicado a espermatozoides frescos ou criopreservados. Solea senegalensis é uma espécie de peixe que desova em água fria, trabalho sempre sob condições de frio (4-7 ° C). Veja a Figura 1</stron...

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

É sabido que as mitocôndrias são organelas chaves para motilidade espermática e função. Estas organelas estão simultaneamente diretamente envolvidas na produção de ROS. Curiosamente, níveis controlados de ROS são necessários para esperma adequado função1. Relações positivas entre fertilidade e estresse oxidativo tem sido demonstradas em mamíferos11 mas níveis excessivos afetam esperma qualidade12. Um fator crucial que pode ser decis...

A produção de espécies reativas de oxigênio tem sido associada com a qualidade do esperma recentemente1. Embora a produção de ROS na mitocôndria pode ser considerada um processo fisiológico normal, estresse oxidativo, por um excesso de produção de ROS é uma clara causa de danos no espermatozoide em diferentes níveis. Em humanos, estresse oxidativo está associado com a infertilidade masculina, alterando a motilidade e a capacidade de se submeter a capacitação2; em mamíferos, alteração da integridade do DNA em amostras de esperma congelado tem sido também relacionada à síntese de H2O23.
Criopreservação é uma técnica comum para gene bancário na aquicultura. Esta tecnologia é particularmente importante em espécies com problemas reprodutivos como Solea senegalensis. Esta espécie valiosa no mercado mostra disfunção reprodutiva em indivíduos nascidos em cativeiro devido à falta de namoro. Este fato torna a criopreservação de esperma necessário ter disponibilidade de esperma para fertilização artificial. No entanto, criopreservação poderia ser uma fonte de estresse oxidativo que pode ser prejudicial para espermatozoides4 como estudos relataram um efeito benéfico da suplementação antioxidante. Inibição de ROS através de antioxidante mitocondrial-alvo foi supostamente benéfica para criopreservação de esperma em bagre amarelo5.
Portanto, os níveis de ROS em amostras de esperma são importantes para saber, particularmente após a criopreservação6,7 , porque estas moléculas foram reconhecidas como uma desvantagem para a sobrevivência de esperma e fertilidade8. Além disso, estudando a distribuição de ROS dentro da célula pode ser crucial para inferir o nível de dano potencial. Por exemplo, baixos níveis de ROS na mitocôndria poderiam ser assumidos normal e compatível com a função de esperma, mas altos níveis de ROS dentro do núcleo podem ser indicadores de danos de DNA de espermatozoides. H2O2 é um do mais relevante ROS que poderia ser libertado da mitocôndria e penetrar no núcleo, porque é uma molécula pequena e sem carga9. Diacetato de diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA) especificamente pode revelar peróxido intracelular emitindo fluorescência verde. Neste artigo, é apresentado um protocolo detalhado para a detecção de H2O2 intracelular localização no esperma de Solea senegalensis usando microscopia confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

Estresse oxidativo é um dos fatores importantes na diminuição da qualidade do esperma. Desenvolvimento de protocolos eficientes para a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de espermatozoides é de grande importância em qualquer espécie, mas esses métodos são usados raramente e ainda menos em teleósteos. Criopreservação é uma técnica útil na aquicultura para diferentes finalidades, incluindo bancos de genes e disponibilidade de esperma ao longo do ano. Procedimentos de congelamento/descongelamento pode causar a produção de ROS e danificar as células de esperma. Considerando os potenciais danos que um excesso de produção de ROS poderia causar em espermatozoides, dependendo da sua localização, aqui uma metodologia detalhada para detectar H2O2 e avaliar sua localização intracelular por microscopia confocal é fornecido. Para este efeito, uma combinação de 3 fluorochromes (2 ′, diacetato de 7 '-Dichlorodihydrofluorescein (Diniz Melo-DA), uma mancha de mitocôndrias ao vivo e 4 ′, dicloridrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) são usados para avaliar a localização co de H2O2 com núcleos de espermatozoides ou mitocôndrias em amostras de esperma de Solea senegalesis .

Microscopia confocal é um método ideal para avaliação de ROS intracelular em teleósteos esperma. A combinação de três fluorochromes (DAPI, uma mancha de mitocôndrias e Diniz Melo-DA) apresentado neste estudo (Figura 1) fornece muitas informações úteis que podem ser aplicados em pesquisa básica e podem ter aplicações em melhorar os procedimentos utilizados na plantas industriais de aquicultura, como protocolos de criopreservação. Diferentes ti...

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Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Este protocolo descreve uma metodologia detalhada para detectar a localização de2 H2O dentro Solea senegalensis espermatozoides usando um fluorocromo sensível Diniz Melo-para ROS, uma mancha de mitocôndrias ao vivo para a mitocôndria e DAPI para núcleos visualização, respectivamente. O protocolo é projetado para ser realizada até 2 horas com espermatozoides descongelados ou frescos.

Avaliação da localização intracelular de espécies reativas de oxigênio em espermatozoides de Solea Senegalensis

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

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Biologia do Desenvolvimento

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