Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Este trabajo fue apoyado por el proyecto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce fue financiado por la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) y el Fondo Social Europeo. Los autores reconocen Dr. Ana Riaza y Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero y José Ramón Guiérrez. También agradecemos a Paula Fernández Colado por videografía.

Nota: Incubación de fluorocromo y análisis confocal tendrá al menos 2-3 h para un control y una muestra tratada. Procesamiento de datos no está incluido en este cálculo de tiempo. Materiales pueden encontrarse en la Tabla de materiales. Este protocolo se puede aplicar a los espermatozoides frescos o criopreservados. Solea senegalensis es una especie de pez que desova en aguas frías, trabajo siempre bajo condiciones de frío (4-7 ° C). Vea la figura 1 para una...

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

Es bien sabido que las mitocondrias son orgánulos claves para la motilidad del esperma y la función. Estos orgánulos están implicados simultáneamente directamente en la producción de ROS. Curiosamente, controlados los niveles de ROS son necesarios para el esperma adecuado función1. Relaciones positivas entre la fertilidad y el estrés oxidativo se ha demostrado en mamíferos11 pero niveles excesivos afectan esperma calidad12. Un factor crucial...

La producción de especies reactivas de oxígeno se ha relacionado con la calidad del esperma recientemente1. Aunque la producción de ROS en la mitocondria puede ser considerada un proceso fisiológico normal, estrés oxidativo por exceso de producción de ROS es una causa clara de daño en los espermatozoides en los diferentes niveles. En los seres humanos, el estrés oxidativo se asocia a infertilidad, alteración de la motilidad y la capacidad de someterse a capacitación2; en los mamíferos, el cambio de la integridad del ADN en las muestras de esperma congelado se ha relacionado también a la síntesis de H2O23.
La criopreservación es una técnica común para la banca en acuicultura, gen. Esta tecnología es particularmente importante en las especies con problemas reproductivos como Solea senegalensis. Esta especie valiosa en el mercado muestra disfunción reproductiva en individuos nacidos en cautividad debido a la falta de cortejo. Este hecho hace que la criopreservación de espermatozoides necesario contar con la disponibilidad de espermatozoides para la fertilización artificial. Sin embargo, la criopreservación podría ser una fuente de estrés oxidativo que podría ser perjudicial para los espermatozoides4 como estudios han reportado un efecto beneficioso de la suplementación con antioxidantes. Inhibición de ROS a través de antioxidantes mitocondriales dirigido fue supuestamente beneficiosa para la criopreservación de espermatozoides en el bagre amarillo5.
Por lo tanto, los niveles de ROS en las muestras de semen son importantes conocer, particularmente después de la criopreservación6,7 ya que estas moléculas han sido reconocidas como una desventaja para la supervivencia de la esperma y fertilidad8. Por otra parte, estudiar la distribución de ROS dentro de la célula podría ser crucial para inferir el nivel de daño potencial. Por ejemplo, bajos niveles de ROS en la mitocondria podrían suponerse normal y compatible con la función del esperma, pero altos niveles de ROS en el núcleo podrían ser indicadores de daño del ADN de espermatozoides. H2O2 es uno de los ROS más relevantes que podrían ser liberados de la mitocondria y penetrar en el núcleo porque es una molécula pequeña y sin carga9. Diacetato de Diclorofluoresceína (DCFH-DA) puede revelar específicamente peróxido intracelular emite fluorescencia verde. En este artículo, se presenta un protocolo detallado para detectar la localización intracelular de H2O2 en Solea senegalensis esperma usando microscopia confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

El estrés oxidativo es uno de los factores importantes en la disminución de la calidad del esperma. El desarrollo de protocolos eficientes para la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) en espermatozoides es de gran importancia en cualquier especie, pero estos métodos son raramente usados y aún menos en teleósteos. La criopreservación es una técnica útil en acuicultura para diversos propósitos, incluyendo banca de gene y garantizada la disponibilidad de espermatozoides durante todo el año. Procedimientos de congelación/descongelación puede causar producción de ROS y dañar las células de esperma. Teniendo en cuenta los posibles dañan podría causar un exceso de producción de ROS en espermatozoides dependiendo de su localización, aquí una metodología detallada para detectar H2O2 y evaluar su localización intracelular mediante microscopía confocal se proporciona. Para ello, se utiliza una combinación de 3 fluorocromos (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una mancha en mitocondrias y 4′, diclorhidrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) para evaluar la co-localización de H2O2 con núcleos de espermatozoides o mitocondrias en Solea senegalesis muestras de esperma.

La microscopia confocal es un método ideal para evaluación de ROS intracelular en teleósteos de la esperma. La combinación de tres fluorocromos (DAPI, una mancha de mitocondrias y DCFH-DA) presentada en este estudio (figura 1) proporcionan mucha información útil que puede ser aplicado en la investigación básica y puede tener aplicaciones en la mejora de procedimientos utilizados en plantas de acuicultura industrial, tales como protocolos de criopreser...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Este protocolo describe una metodología detallada para detectar la localización de2 H2O en Solea senegalensis espermatozoides con un fluorocromo sensible DCFH-DA para ROS, una mancha de mitocondrias vivo para las mitocondrias y DAPI para núcleos visualización, respectivamente. El protocolo está diseñado para ser realizado dentro de 2 h con espermatozoides frescos o descongelados.

Evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea Senegalensis

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Tonina Delfín (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolección, criopreservación y fecundación In Vitro heteróloga

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Inmovilización de Caenorhabditis elegans para analizar el transporte intracelular en las neuronas

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...