Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Vi tackar AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av AGL201568330-C2-1-R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce finansierades av Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) och Fondo Social Europeo. Författarna erkänner Dr Ana Riaza och Stolt Sea Farm S.A., Dr Paulino de Paz, Dr Ignacio Martínez Montero och José Ramón Guiérrez. Vi tackar också Paula Fernández Colado för videography.

Not: Fluorokrom inkubation och confocal analys tar minst 2-3 h för en kontroll och en behandlade provet. Behandling av uppgifter ingår inte i denna tidberäkning. Nödvändigt material kan hittas i Tabellen för material. Detta protokoll kan tillämpas på färskt eller nedfrysta spermier. Solea senegalensis är en fisk som leker i kallt vatten, arbete alltid under kalla förhållanden (4-7 ° C). Se figur 1 för en allmän bild av protokollet.
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

Det är väl känt att mitokondrierna är viktiga organeller för spermiernas rörlighet och funktion. Dessa organeller är samtidigt direkt involverade i ROS produktion. Intressant, behövs kontrollerade nivåer av ROS för korrekt spermier funktion1. Positiva relationer mellan fertilitet och oxidativ stress har visats i däggdjur11 men alltför höga halter påverka spermier kvalitet12. En avgörande faktor som kan vara avgörande för en positiv e...

Reaktivt syre arter produktionen har kopplats till spermiekvalitet nyligen1. Även om ROS produktion i mitokondrier kan anses vara en normal fysiologisk process, är oxidativ stress av ett överskott av ROS produktion en tydlig orsak till skador i spermier på olika nivåer. I människor associeras oxidativ stress med manlig infertilitet, förändra motilitet och en förmåga att genomgå capacitation2; hos däggdjur, har förändring av DNA integritet i frysta spermier prover varit också relaterade till syntesen av H2O23.
Frysförvaring är en vanlig teknik för gen banking i vattenbruk. Denna teknik är särskilt viktigt för arter med reproduktiva problem såsom Solea senegalensis. Denna värdefulla arter på marknaden visar reproduktiv dysfunktion i individer födda i fångenskap på grund av uppvaktning. Detta faktum gör spermier frysförvaring nödvändigt att ha spermier tillgänglighet för konstgjord befruktning. Frysförvaring kan dock en källa till oxidativ stress som kan vara skadliga för spermier4 som studier har rapporterat en gynnsam effekt av antioxidant tillskott. ROS hämning genom mitokondrie-riktade antioxidant var enligt uppgift fördelaktigt för Frysförvaring av spermier i gula havskatt5.
Nivåerna av ROS i spermier prover är därför viktigt att veta, särskilt efter frysförvaring6,7 eftersom dessa molekyler har erkänts som en nackdel för spermier överlevnad och fertilitet8. Dessutom kan det vara avgörande att härleda potentiella skadenivå studerar fördelningen av ROS i cellen. Som ett exempel, låga nivåer av ROS i mitokondrierna kunde antas normalt och kompatibel med spermier-funktionen, men höga nivåer av ROS inom kärnan kan vara indikatorer på spermier DNA-skador. H2O2 är en av de mest relevanta ROS som kunde frigöras från mitokondrierna och penetrera kärnan eftersom det är en liten och kostnad-mindre molekyl9. Dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kan specifikt avslöja intracellulära peroxid avger grön fluorescens. I den här artikeln presenteras ett detaljerat protokoll för att upptäcka H2O2 intracellulära lokalisering i Solea senegalensis spermier med konfokalmikroskopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol, Analytical Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MitoTrackerDeep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge (refrigerated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neubauerchamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10143562BEF</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

Oxidativ stress är en av de viktigaste faktorerna för minskar spermiernas kvalitet. Utveckla effektiva protokoll för att upptäcka reaktiva syreradikaler (ROS) i spermier är av stor betydelse i alla arter, men dessa metoder är används sällan och ännu mindre i benfisk. Frysförvaring är en användbar teknik i vattenbruk för olika ändamål, inklusive gen bank och garanterad spermier tillgänglighet under hela året. Frysning/upptining förfaranden kan orsaka ROS produktion och skada spermacellerna. Med tanke på den potentiella skada som kan ett överskott av ROS produktion orsaka i spermatozoa beroende på deras localization, här en detaljerad metod att upptäcka H2O2 och utvärdera dess intracellulära lokalisering av konfokalmikroskopi tillhandahålls. För detta ändamål används en kombination av 3 fluorokromer (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), en levande mitokondrier fläcken och 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI)) att utvärdera samtidig localizationen av H2O2 med spermier kärnor eller mitokondrier i Solea senegalesis spermier prover.

Konfokalmikroskopi är en idealisk metod för intracellulära ROS utvärdering i lever spermier. Kombinationen av de tre fluorokromer (DAPI, mitokondrier fläcken och DCFH-DA) presenteras i denna studie (figur 1) ger många användbar information som kan användas i grundforskning och kan ha program för att förbättra förfaranden som används i industriella vattenbruk växter, såsom frysförvaring protokoll. Olika typer av analyser kan utföras för att k...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Det här protokollet beskriver en detaljerad metod för att upptäcka H2O2 lokalisering inom Solea senegalensis spermier med en känslig fluorokrom DCFH-DA för ROS, en levande mitokondrier fläcken för mitokondrier och DAPI för kärnor visualisering, respektive. Protokollet är avsett att utföras inom 2 h med antingen färska eller tinade spermier.

Utvärdering av intracellulära läge av reaktiva syreradikaler i Solea Senegalensis spermier

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermier: insamling, frysförvaring och heterologa In Vitro fertilisering

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och In Vivo omprogrammering i skelettmuskulaturen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder för Imaging intracellulära pH av follikeln Stem Cell härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

En kvantitativ mätning av reaktiva syreradikaler och åldras-associerade sekretoriska fenotyp i normala mänskliga fibroblaster under onkogen-inducerad åldras

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Confocal levande avbildning av skjuta Apical Meristems från olika växtarter

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Utvärdering av fertilisering staten genom att spåra spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...