Name: analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

ويدعم الفريق الاستشاري من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحوث (وكالة الاستخبارات الوطنية-13-JSV1-0008)، من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (ماري كوري التكامل الوظيفي n˚8304162) ومن مجلس الأبحاث الأوروبي (ERC) تحت الأفق الاتحاد الأوروبي 2020 البحوث والابتكار برنامج (ERC ابتداء غرانت n˚639300).

1. يجند الإقتران إلى الخرز المغناطيسي ملاحظة: يتم تنفيذ اقتران يجند باستخدام الخرز تفعيلها tosyl مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic مع 2.8 ميكرون قطر (تركيز الأسهم حل 10 8 حبات / مل، 30 ملغم حبات / مل). ويستند البروتوكول التالية على عينا?...

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+forces:+architectural+control+of+mechanotransduction.">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).</li><li>Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adaptation+to+mechanical+stress:+role+of+integrins,+Rho,+cytoskeletal+tension+and+mechanosensitive+ion+channels.">Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels.</a> J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).</li><li>Zhao, X. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+activates+smooth+muscle+alpha-actin+promoter+activity+through+the+Rho+signaling+pathway.">Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+biosensors+to+measure+mechanical+forces+within+cells.">Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells.</a> Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. l. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+atomic+force+microscopy+and+side-view+optical+imaging+for+mechanical+studies+of+cells.">Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells.</a> Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).</li><li>Bays, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinculin+phosphorylation+differentially+regulates+mechanotransduction+at+cell-cell+and+cell-matrix+adhesions.">Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions.</a> J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+tensional+forces+on+PECAM-1+elicit+a+global+mechanotransduction+response+via+the+integrin-RhoA+pathway.">Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway.</a> Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).</li><li>Gordon, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Allostery:+Evidence+for+a+Force+Requirement+in+the+Proteolytic+Activation+of+Notch.">Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch.</a> Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).</li><li>Lessey-Morillon, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoA+guanine+nucleotide+exchange+factor,+LARG,+mediates+ICAM-1-dependent+mechanotransduction+in+endothelial+cells+to+stimulate+transendothelial+migration.">The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration.</a> J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).</li><li>Osborne, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+regulates+LARG+and+GEF-H1+during+EMT+to+affect+stiffening+response+to+force+and+cell+invasion.">TGF-&#946; regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).</li><li>Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+on+JAM-A+activates+RhoA+via+GEF-H1+and+p115+RhoGEF.">Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF.</a> Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).</li><li>Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+fields+applied+to+collagen-coated+ferric+oxide+beads+induce+stretch-activated+Ca2++flux+in+fibroblasts.">Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts.</a> Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).</li><li>Glogauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+and+tyrosine+phosphorylation+interact+coordinately+with+actin+to+regulate+cytoprotective+responses+to+stretching.">Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching.</a> J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).</li><li>Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+myosin-II-responsive+focal+adhesion+proteome+reveals+a+role+for+&#946;-Pix+in+negative+regulation+of+focal+adhesion+maturation.">Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for &#946;-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).</li><li>Schiller, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;1-+and+&#945;v-class+integrins+cooperate+to+regulate+myosin+II+during+rigidity+sensing+of+fibronectin-based+microenvironments.">&#946;1- and &#945;v-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+nuclei+adapt+to+force+and+reveal+a+mechanotransduction+pathway+in+the+nucleus.">Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus.</a> Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).</li><li>Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+integrin+and+growth+factor+receptor+signaling+pathways+within+the+focal+adhesion+complex.">Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex.</a> Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).</li><li>Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+alpha(5)beta(1)+integrins+determines+adhesion+strength+whereas+alpha(v)beta(3)+and+talin+enable+mechanotransduction.">Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).</li><li>Ajeian, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin-associated+complexes+from+mesenchymal+stem+cells.">Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells.</a> Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).</li><li>Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+integrin+adhesion+complexes:+Role+of+the+consensus+adhesome.">Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome.</a> Exp Cell Res. , (2015).</li><li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+integrin-based+adhesion+complexes.">Isolation of integrin-based adhesion complexes.</a> Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).</li><li>Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Fr&#233;millon, A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+modulation+of+adhesion+complex+composition.">Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition.</a> PloS One. 9 (12), e115213 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin+adhesion+complexes.">Proteomic analysis of integrin adhesion complexes.</a> Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+&#945;4&#946;1+integrin+adhesion+complexes+reveals+&#945;-subunit-dependent+protein+recruitment.">Proteomic analysis of &#945;4&#946;1 integrin adhesion complexes reveals &#945;-subunit-dependent protein recruitment.</a> Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).</li><li>Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+magnets+and+magnetic+beads+to+dissect+signaling+pathways+activated+by+mechanical+tension+applied+to+cells.">Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells.</a> Methods. , (2015).</li><li>Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+activity+regulates+vinculin+recruitment+to+focal+adhesions+through+FAK-mediated+paxillin+phosphorylation.">Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation.</a> J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).</li><li>Sawada, Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transduction+by+Triton+cytoskeletons.">Force transduction by Triton cytoskeletons.</a> J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).</li><li>Grinnell, F., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+fibronectin-coated+beads+with+attached+and+spread+fibroblasts.+Binding,+phagocytosis,+and+cytoskeletal+reorganization.">Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization.</a> Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).</li><li>Schroeder, F., Kinden, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+using+fluorescent+latex+beads.">Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads.</a> J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).</li><li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction.">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li><li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time.">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li></ol>

الطريقة الموصوفة هنا يشكل نهجا واضحة لتطبيق التوتر لمستقبلات الالتصاق سطح الخلية والسماح تنقية لاحقا. ومع ذلك، بعض الخطوات الهامة لأداء كفاءة تنقية التصاق وتحسين محتمل يمكن أن يتم اعتمادا على المستقبلات التصاق المستهدفة. نقدم المشاكل المحتملة التي قد يواجهها المس?...

في metazoa والتوتر الميكانيكية يوجه تطوير الأنسجة والتوازن خلال تنظيم عدد لا يحصى من عمليات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، والتمايز والبقاء على قيد الحياة 1 و 2. التوتر الميكانيكية يمكن أن تنشأ من المصفوفة خارج الخلية أو يمكن أن تتولد من قبل الخلايا الملتصقة، التي عينة بيئة خارج الخلية من خلال آلية مقلص أكتوميوزين التي تشد على المصفوفة خارج الخلية و المسابير صلابة من خلال جزيئات والتوتر الحساسة. وردا على التوتر والبروتينات التصاق mechanosensitive تخضع التغييرات متعلق بتكوين التي تؤدي شلالات الإشارات المعقدة. في المقابل، هذه المسارات يشير تنسق mechanoresponse تشمل الانتشار، والتمايز والبقاء على قيد الحياة أن يضبط السلوك الخلوي للبيئة خارج الخلية. هذه العمليات يمكن تسويتها في فترة زمنية قصيرة الأجل (ثواني إلى دقائق) لتغذية بسرعة مرة أخرى على حلقة من ميكا<html> notransduction عن طريق تعديل الهياكل mechanosensitive. على سبيل المثال، التصاقات القائم على إنتغرين تعزز ردا على التوتر من خلال توسط GTPase-رو هيكل الخلية إعادة عرض 3، 4، 5. في موازاة ذلك، يتم تفعيل مسارات إشارات أخرى خلال الساعات والأيام للسيطرة على برامج الوراثية التي تؤثر في نهاية المطاف خلية مصير 6. في حين أن العديد من الدراسات قد سلط الضوء على تأثير تصلب مصفوفة على الحتمية الخلية وتطور المرض 1، 2، الآليات الجزيئية الدقيقة للmechanotransduction بوساطة الالتصاق لا يزال بعيد المنال. وقد تم تطوير مناهج مختلفة لدراسة تأثيرات القوى المولدة خلية أو القوى الخارجية على سلوك الخلية، بما في ذلك نظم تدفق ونقل مضان الطاقة الرنين (الحنق) أجهزة الاستشعار -tension 7،معشوقة = &quot;XREF&quot;&gt; 8، ركائز متوافقة 9، ملاقط المغناطيسية، ملاقط بصرية 10 و مجهر القوة الذرية (AFM) 11. هنا نقدم بروتوكول باستخدام الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتوصيف مسارات mechanotransduction استجابة لقوى المتوترة تطبيقها على مستقبلات الالتصاق محددة. حبات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic هي الجزيئات التي جذب عكسية عند وضعها في مجال مغناطيسي. مرة واحدة المغلفة مع يجند لمستقبلات محددة، وتوفر هذه الخرز أداة قوية لدراسة آثار تطبيق قوة خارج الخلية. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة من قبل العديد من الدراسات 3، 5، 12-17 ويقدم ميزة لتسهيل تحليل الكيمياء الحيوية إلى حد كبير على الخلايا الملتصقة. باستخدام الخرز المغناطيسي المغلفة الكولاجين مماثلة تليها تحليل الكيمياء الحيوية، وذكر العمل في وقت مبكر زيادة فيبروتين تيروزين الفسفرة وتفعيل RhoA ردا على التوتر 5، 18، 19. كما تم استخدام الأسلوب هو موضح أدناه مع فبرونيكتين (FN) الخرز المغلفة لتوصيف مسارات إشارات المصب من التوتر تطبق على integrins 3. في هذه الدراسة، Guilluy وآخرون. أظهرت أن التوتر ينشط RhoA من خلال تعيين اثنين من العوامل الصرف جوانين النوكليوتيدات (GEFs)، LARG ومرفق البيئة العالمية-H1، إلى المجمعات التصاق إنتغرين. ومنذ ذلك، أظهرت دراسات أخرى أن GEF-H1 يتم تجنيده لالمجمعات الالتصاق ردا على التوتر ولدت الخلية باستخدام أساليب مختلفة 20، 21، مما يدل على متانة المنهجية الواردة هنا. ونتيجة لذلك، فقد تبين RhoA تفعيلها لتعزيز التصاق التعزيز، من خلال إعادة تشكيل هيكل الخلية. وقد استخدم هذا النظام أيضا لاستكشاف التوتر تطبيقها رس مستقبلات الخلايا / التصاق الخلية. تطبيق القوات على حبات مغناطيسية المغلفة مع المجال خارج الخلية من E-كادهيرين الناجم عن زيادة في التوظيف فينكولين على نحو مماثل لإنتغرين المرتبطة المجمعات التصاق 12. ولاحظ كولينز وزملاؤه أن تطبيق التوتر PECAM-1 يشجع إنتغرين وتفعيل RhoA 13. المنهج التجريبي آخر باستخدام الخرز المغناطيسي هو دراسة التوتر تطبيقها على نواة معزولة. باستخدام حبات مغلفة مع أجسام مضادة ضد بروتين الغلاف النووي nesprin-1، وتنقية المجمعات المغلف النووية أن تظهر أنها تنظم حيوي في استجابة للتوتر الميكانيكية 22. وتدعم هذه النتائج تتحول القوة من هذه الطريقة في دراسة مسارات mechanotransduction. وعلاوة على ذلك، في حين نظم تدفق أو قوة الجر تحفز العمليات الخلوية العامة، الخرز المغناطيسي تستهدف على وجه التحديد مستقبلات التصاق الخلية باستخدام إما بروابط مستقبلات <suص الطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 3 أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد مستقبلات سطح الخلية 13 و 15. ميزة أخرى لهذه الطريقة هي عزلة المجمعات الالتصاق من خلال إجراء تنقية تقارب يجند مباشرة. ومن المعروف أن إضافة حبات المغلفة يجند للخلايا تربط مستقبلات الالتصاق ويستحث تجنيد العديد من البروتينات التصاق 23. تطبيق مزيد من القوات إلى حبات مغناطيسية المغلفة يجند يتحول هذه المجمعات التصاق إلى منصات الجزيئات التي تتوسط المختلفة التي تعتمد على التوتر مسارات الإشارات 4، 24. تحلل الخلية تليها تركيز حبة باستخدام مغناطيس يسمح عزل منصات التصاق. وقد تم بالفعل استخدام أساليب أخرى تستخدم في تنقية المجمعات الالتصاق في الخلايا الملتصقة. فهي تجمع بين يشابك الكيميائية للحفاظ على تفاعلات البروتين البروتينوخطوة خلية تحلل من المنظفات وتدفق القص أو صوتنة 20، 21، 25، 26، 27، 28. والخطوة الأخيرة هي جمع ينتج عن ذلك من أغشية البلازما البطنية التي تحتوي على مجمعات التصاق. وخلافا لهذه الأساليب، حبات مغناطيسية تسمح بمستوى تنقية أكبر المجمعات التصاق الخلية من خلال استهداف انتقائي عائلة محددة من مستقبلات الالتصاق. وقد تم بالفعل استخدام الخرز المغناطيسي لتنقية المجمعات الالتصاق في الخلايا غير ملتصقة تعلق على ميكروبيدات المغلفة يجند 29، 30. الأسلوب هو موضح أدناه الحالات البيولوجية يقلد حيث يتم تطبيق قوة لفترة طويلة قصيرة (ثواني إلى دقائق). ولذلك، فإنه يوفر أداة قوية للتحقيق في كل من التركيب الجزيئي للمجمعات التصاق تنقيته ومسارات المصب يشير mechanosensitive. هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل لاستخدام حبات مغناطيسية لتطبيق القوات المتوترة للبروتينات سطح الالتصاق. يتم وضع مغناطيس النيوديميوم دائم على الجزء العلوي من سطح الطبق الثقافة. يتم وضع وجهه قطب المغناطيس على ارتفاع 6 مم بحيث القوة على 2.8 ميكرومتر حبة المغناطيسي واحد هو ثابت (حوالي 30-40 السندات الإذنية) 31. يتم تحديد مدة التحفيز التوتر من قبل المشغل اعتمادا على جزيء من الفوائد ولها على نطاق ووقت التنشيط. وهي lysed الخلايا أخيرا، يتم تنقية المجمعات التصاق بواسطة فصل حبات باستخدام مغناطيس وتتم معالجة التحليلات الكيميائية الحيوية. ويشمل هذا البروتوكول إعداد حبات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic المغلفة يجند، وتطبيق التوتر من خلال المغناطيس تليها التحليلات الكيميائية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم عينة تمثيلية من البيانات مما يدل على أن التوتر تطبيقها على معاذ القائم على إنتغرينesions يدفع التصاق إعادة عرض ويغير البروتين التيروزين الفسفرة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td>
			<td style="width:115px;">K&#38;J Magnetics, Inc</td>
			<td style="width:103px;">DX88-N52</td>
			<td style="width:375px;">grade N52 dimension: 1 1/2&#34; dia. x 1/2&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td>
			<td style="width:115px;">K&#38;J Magnetics, Inc</td>
			<td style="width:103px;">D84PC-BLK</td>
			<td>grade N42 dimension: 1/2&#34; dia. x 1/4&#34; thick Black Plastic Coated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dynabeads M280 Tosylactivated</td>
			<td style="width:115px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:103px;">14203</td>
			<td>superparamagnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:115px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:103px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fibronectin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">F1141-5MG</td>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Apo-Transferrin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">T1428-50MG</td>
			<td>Bovine Apo-Transferrin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:103px;">31966-021</td>
			<td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60*15 mm culture dish</td>
			<td style="width:115px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

المجمعات التصاق سطح الخلية Mechanosensitive يسمح للخلايا لاستشعار الخصائص الميكانيكية للمحيطهم. وقد حددت الدراسات الحديثة على حد سواء جزيئات الاستشعار القوة في مواقع الالتصاق، وعوامل النسخ التي تعتمد على القوة التي تنظم التعبير الجيني النسب المحددة ودفع مخرجات المظهرية. ومع ذلك، ظلت شبكات الإشارات تحويل التوتر الميكانيكية في الممرات الحيوية بعيد المنال. لاستكشاف مسارات الإشارات تعمل على التوتر الميكانيكية المطبقة على مستقبلات سطح الخلية، ميكروبيدات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic يمكن استخدامها. هنا نقدم بروتوكول لاستخدام حبات مغناطيسية لتطبيق قوى للبروتينات التصاق سطح الخلية. باستخدام هذا النهج، فمن الممكن للتحقيق ليس فقط مسارات الإشارات هيولي التي تعتمد على القوة من قبل النهج البيوكيميائية المختلفة، ولكن أيضا إعادة عرض التصاق بواسطة العزلة المغناطيسية المجمعات الالتصاق تعلق حبات المغلفة يجند. ويشمل هذا البروتوكول إعداد يجند المشتركATED الخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، وتطبيق تحدد قوات الشد تليها التحليلات الكيميائية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم عينة تمثيلية من البيانات مما يدل على أن التوتر تطبيقها على التصاق القائم على إنتغرين مشغلات التصاق إعادة عرض ويغير البروتين التيروزين الفسفرة.

ويتضح التخطيطي للتقنية في الشكل 1A. بعد اقتران يجند، يتم تحضين حبات مغناطيسية مع الخلايا لمدة 20 دقيقة، ثم يستخدم المغناطيس الدائم لتطبيق قوى الشد من حوالي 30-40 السندات الإذنية لكمية مختلفة من الزمن. ويبين الشكل 1B 2.8 ميكرون الخرز المغناطيسي المغلفة FN-ب...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

التصاقات سطح الخلية هي المركزية في mechanotransduction، كما نقل التوتر الميكانيكية والشروع في مسارات الإشارات المشاركة في توازن الأنسجة والتنمية. هنا، نقدم بروتوكول لتشريح المسارات البيوكيميائية التي يتم تفعيلها في فعل للتوتر، وذلك باستخدام ميكروبيدات المغناطيسي المغلفة يجند وتطبيق قوة لمستقبلات الالتصاق.

تحليل الخلايا السطحية التصاق إعادة عرض في الاستجابة للتوتر الميكانيكية باستخدام الخرز المغناطيسي

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

باستخدام مايكرو سيستمز الكهربائية والميكانيكية (ممس) لتطوير أدوات التشخيص

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...