Name: analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

CG, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), (Marie Curie Kariyer Entegrasyon n˚8304162) ve Avrupa Birliği&#39;nin Horizon kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) hibe tarafından desteklenmektedir 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC Başlangıç ​​Hibe n˚639300).

Manyetik Boncuk 1. Ligand Konjugasyon Not: Ligand konjügasyon 2.8 mikron çapında olan süperparamanyetik tosil-aktive boncuklar kullanılarak gerçekleştirilir (stok çözelti konsantrasyonu 10 8 boncuk / mL, 30 mg tane / mL) eklenmiştir. Aşağıdaki protokol, bir 60 mm doku kültürü plakası içinde% 80 konfluansa büyütülmüş MRC-5 hücreleri için uygun, yaklaşık 2 x 10 5 hücre, örnekleri dayanır. buna göre farklı akışlar farklı boyutlarda veya hü...

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+forces:+architectural+control+of+mechanotransduction.">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).</li><li>Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adaptation+to+mechanical+stress:+role+of+integrins,+Rho,+cytoskeletal+tension+and+mechanosensitive+ion+channels.">Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels.</a> J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).</li><li>Zhao, X. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+activates+smooth+muscle+alpha-actin+promoter+activity+through+the+Rho+signaling+pathway.">Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+biosensors+to+measure+mechanical+forces+within+cells.">Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells.</a> Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. l. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+atomic+force+microscopy+and+side-view+optical+imaging+for+mechanical+studies+of+cells.">Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells.</a> Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).</li><li>Bays, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinculin+phosphorylation+differentially+regulates+mechanotransduction+at+cell-cell+and+cell-matrix+adhesions.">Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions.</a> J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+tensional+forces+on+PECAM-1+elicit+a+global+mechanotransduction+response+via+the+integrin-RhoA+pathway.">Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway.</a> Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).</li><li>Gordon, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Allostery:+Evidence+for+a+Force+Requirement+in+the+Proteolytic+Activation+of+Notch.">Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch.</a> Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).</li><li>Lessey-Morillon, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoA+guanine+nucleotide+exchange+factor,+LARG,+mediates+ICAM-1-dependent+mechanotransduction+in+endothelial+cells+to+stimulate+transendothelial+migration.">The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration.</a> J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).</li><li>Osborne, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+regulates+LARG+and+GEF-H1+during+EMT+to+affect+stiffening+response+to+force+and+cell+invasion.">TGF-&#946; regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).</li><li>Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+on+JAM-A+activates+RhoA+via+GEF-H1+and+p115+RhoGEF.">Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF.</a> Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).</li><li>Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+fields+applied+to+collagen-coated+ferric+oxide+beads+induce+stretch-activated+Ca2++flux+in+fibroblasts.">Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts.</a> Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).</li><li>Glogauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+and+tyrosine+phosphorylation+interact+coordinately+with+actin+to+regulate+cytoprotective+responses+to+stretching.">Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching.</a> J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).</li><li>Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+myosin-II-responsive+focal+adhesion+proteome+reveals+a+role+for+&#946;-Pix+in+negative+regulation+of+focal+adhesion+maturation.">Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for &#946;-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).</li><li>Schiller, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;1-+and+&#945;v-class+integrins+cooperate+to+regulate+myosin+II+during+rigidity+sensing+of+fibronectin-based+microenvironments.">&#946;1- and &#945;v-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+nuclei+adapt+to+force+and+reveal+a+mechanotransduction+pathway+in+the+nucleus.">Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus.</a> Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).</li><li>Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+integrin+and+growth+factor+receptor+signaling+pathways+within+the+focal+adhesion+complex.">Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex.</a> Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).</li><li>Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+alpha(5)beta(1)+integrins+determines+adhesion+strength+whereas+alpha(v)beta(3)+and+talin+enable+mechanotransduction.">Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).</li><li>Ajeian, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin-associated+complexes+from+mesenchymal+stem+cells.">Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells.</a> Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).</li><li>Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+integrin+adhesion+complexes:+Role+of+the+consensus+adhesome.">Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome.</a> Exp Cell Res. , (2015).</li><li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+integrin-based+adhesion+complexes.">Isolation of integrin-based adhesion complexes.</a> Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).</li><li>Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Fr&#233;millon, A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+modulation+of+adhesion+complex+composition.">Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition.</a> PloS One. 9 (12), e115213 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin+adhesion+complexes.">Proteomic analysis of integrin adhesion complexes.</a> Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+&#945;4&#946;1+integrin+adhesion+complexes+reveals+&#945;-subunit-dependent+protein+recruitment.">Proteomic analysis of &#945;4&#946;1 integrin adhesion complexes reveals &#945;-subunit-dependent protein recruitment.</a> Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).</li><li>Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+magnets+and+magnetic+beads+to+dissect+signaling+pathways+activated+by+mechanical+tension+applied+to+cells.">Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells.</a> Methods. , (2015).</li><li>Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+activity+regulates+vinculin+recruitment+to+focal+adhesions+through+FAK-mediated+paxillin+phosphorylation.">Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation.</a> J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).</li><li>Sawada, Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transduction+by+Triton+cytoskeletons.">Force transduction by Triton cytoskeletons.</a> J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).</li><li>Grinnell, F., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+fibronectin-coated+beads+with+attached+and+spread+fibroblasts.+Binding,+phagocytosis,+and+cytoskeletal+reorganization.">Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization.</a> Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).</li><li>Schroeder, F., Kinden, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+using+fluorescent+latex+beads.">Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads.</a> J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).</li><li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction.">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li><li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time.">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li></ol>

Burada tarif edilen yöntem, hücre yüzeyi yapışma reseptörlerine gerilim uygulamak ve daha sonra saflaştırmaya olanak sağlamak üzere basit bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, bazı adımlar hedeflenen yapışma reseptörleri bağlı verimli yapışma arıtma ve potansiyel iyileştirme yapılabilir gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir. Biz kullanıcı aşağıda karşılaşabileceğiniz olası sorunları sunuyoruz. Bu 2.8 mikron çapında manyetik boncuklar kullanılab...

Metazoada olarak, mekanik gerilme, proliferasyon, farklılaşma ve canlılık, 1, 2 gibi hücresel süreçleri sayısız düzenleme ile doku gelişimi ve homeostazı yönlendirir. Mekanik gerilim hücre dışı matrisin ortaya çıkabilir veya yapışık hücreler, örnek hücre-dışı matris üzerine çeker ve gerginlik duyarlı moleküllerin yoluyla sertliğini probları aktomiyosin kontraktil makineler yoluyla hücre dışı ortamı ile üretilebilir. gerilime karşılık olarak, mechanosensitive yapışma proteinleri, karmaşık bir sinyal gruplarının tetiklenmesinde uygun değişikliklere uğrar. Buna karşılık, bu sinyal yolları hücre dışı ortama hücresel davranış ayarlar proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma kapsayan bir mechanoresponse orkestra. Bu tür süreçler hızla mekanizmalarının döngü üzerine geri beslemeye (saniye dakika) kısa vadeli bir sürede çözülebilecek<html> mechanosensitive yapıları değiştirerek notransduction. Örneğin, integrin göre yapışıklık Rho GTPaz aracılı hücre iskeleti yeniden 3, 4, 5 arasındaki gerilim yanıt olarak güçlendirir. Buna paralel olarak, diğer sinyal yollarının sonunda hücre kaderi 6 etkileyen genetik programları kontrol etmek için saat ve gün içinde aktif hale getirilir. Birçok çalışma, hücre determinizm ve hastalık gelişimi 1, 2 matris sertlik etkisini vurgulamıştır Oysa, yapışma aracılı mechanotransduction kesin moleküler mekanizmalar hala zor kalır. Çeşitli yaklaşımlar, akış sistemleri, flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) -tension sensörleri 7 de dahil olmak üzere hücre davranışı hücre tarafından üretilen kuvvetler veya dış kuvvetlerin etkilerini incelemek için geliştirilmiştirlass = &quot;xref&quot;&gt; 8 uyumlu yüzeyler 9, manyetik cımbız, optik cımbız 10 ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 11. Burada belirli bir yapışma reseptörleri uygulanan gerilme kuvvetlerine karşılık olarak mechanotransduction yolları karakterize süperparamanyetik boncuklar kullanılarak, bir protokol mevcut. Süperparamanyetik boncuklar bir manyetik alan içine konulduğunda, tersine çevrilebilir manyetize parçacıklardır. Bir kez özel bir reseptör için bir ligand ile kaplı, bu boncuklar hücre dışı bir güç uygulamanın etkilerini incelemek için güçlü bir araç sunar. Bu yöntem bazı çalışmalarda 3, 5, 12 ile onaylandı - 17 ve büyük ölçüde yapışık hücreleri üzerinde biyokimyasal analizi kolaylaştırmak için avantaj sunuyoruz. Biyokimyasal analizi ile takip benzer kollajen kaplı manyetik boncuklar kullanılarak, erken iş bir artış olduğunu bildirdigerilim 5, 18, 19 karşılık olarak protein tirozin fosforilasyon ve RhoA aktivasyonu. Aşağıda tarif edilen yöntem, aynı zamanda integrin 3 uygulanan gerilimden aşağı sinyalleme yolunu tanımlamak için fibronektin (FN) kaplı boncuklar ile kullanılmıştır. Bu çalışmada, Guilluy ve ark. gerginlik integrin yapışma kompleksleri iki guanin nükleotid değişim faktörleri (gefs), LARG ve GEF-H1, işe yoluyla RhoA aktive olduğunu gösterdi. Bu yana, diğer çalışmalar GEF-H1, burada açıklanan metodolojiye sağlamlığını gösteren farklı yöntemler 20, 21 kullanılarak hücre tarafından üretilen gerilim yanıt olarak yapışma kompleksleri için işe olduğunu göstermiştir. Bunun bir sonucu olarak, aktive edilmiş RhoA sitoskeletal yeniden ile, yapışma takviye sağladığı gösterilmiştir. Bu sistem, aynı zamanda gerilim tatbik t araştırmak için kullanıldıHücre / hücre adezyon reseptörleri o. İntegrin ilişkili adhezyon kompleksleri 12 benzer vinkulin işe bir artışa neden olmadan E-kaderin hücre dışı kaplanmış manyetik boncuklar üzerine kuvvetlerinin uygulanması. Collins ve arkadaşları PECAM-1 integrin teşvik ve RhoA aktivasyonu 13 gerginlik bu uygulama görülmektedir. manyetik boncuklar kullanarak başka deneysel bir yaklaşım izole çekirdekleri uygulanan gerilim çalışmadır. Nesprin-1 çekirdek zarı proteine karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak, çekirdek zarı kompleksleri dinamik mekanik gerilim 22 yanıt olarak ayarlanır olduğunu göstermek için saflaştırılmıştır. Bu sonuçlar, mechanotransduction yollarının çalışmada bu yöntemin güçlülüğü destekler. Akış veya çekme kuvveti sistemleri genel olarak hücresel işlemleri teşvik Dahası, manyetik boncuk özel reseptör ligandları kullanarak, bir hücre yapışma reseptörünü hedefleyen 13, 15 karşı monoklonal antikorlar. Bu yöntemin diğer bir avantajı, basit bir bağ afinite saflaştırma prosedürü ile yapışma komplekslerinin izolasyondur. İyi hücrelere ligand kaplı boncuklar ilave yapışma reseptörleri bağlayan ve çeşitli yapışma proteinlerinin 23 alımı uyardığı bilinmektedir. Ligand kaplı manyetik boncuklar kuvvetlerin daha uygulaması 24, farklı gerilim bağımlı sinyalleme yolunu 4 aracılık makromoleküler platformlara bu yapışma kompleksleri döner. Bir mıknatıs kullanılarak kordon konsantrasyon izledi hücre liziz yapışma platformları izolasyonunu mümkün kılar. adezyon kompleksleri saflaştırmak için kullanılan diğer yöntemler, daha önce yapışkan hücreler kullanılmaktadır. Bunlar protein-protein etkileşimlerini muhafaza etmek için kimyasal çapraz-bağlanmasını birleştirirve deterjan ve kesme akış veya sonikasyon 20, 21, 25, 26, 27, 28, bir hücre parçalama adımı. Son adım yapışma kompleksleri içeren nihai ventral plazma zarlarının topluluğudur. Bu yöntemlerden farklı olarak, manyetik boncuk seçici adezyon reseptörlerinin özel bir ailesi hedef hücre yapışması kompleksleri daha büyük bir saflaştırma seviyesi sağlar. Manyetik boncuklar daha önce ligand kaplı mikro-29, 30 bağlı yapışmayan hücreler adezyon kompleksleri saflaştırılması için kullanılmıştır. kuvvet, kısa sürekli bir süre (dakika saniye) uygulanır taklit biyolojik durumlar aşağıda açıklanan yöntem. Bu nedenle, arıtılmış yapışma komplekslerinin moleküler kompozisyonu hem de soruşturma için güçlü bir araç sağlar veaşağı mechanosensitive-sinyal yolları. Burada yapışma yüzey proteinlerine gerilme kuvvetlerinin uygulamak için manyetik boncuklar kullanılarak için ayrıntılı bir deneysel protokol mevcut. Kalıcı Neodimyum mıknatıs kültür çanak yüzeyinin üstüne yerleştirilir. Tek bir 2.8 mikron manyetik boncuk kuvvet sabiti (yaklaşık 30-40 pN) 31 böylece mıknatıs kutup yüzü 6 mm yükseklikte yer almaktadır. Germe uyarım süresi çıkar ve aktivasyon zamanı ölçekli molekülüne bağlı olarak operatör tarafından belirlenir. Hücreler nihayet yapışma kompleksleri bir mıknatıs kullanarak boncuk ayırma ile saflaştırılmış ve biyokimyasal analizler işlenir, parçalanır. Bu protokol, ligand kaplamalı süperparamanyetik tanelerin hazırlanması ve biyokimyasal analizler, ardından Mıknatıs gerilim uygulanmasını içerir. Ayrıca, integrin tabanlı ADH uygulanan bu gerilim gösteren bir veri temsil eden örnek sunmakesions yapışma biçimlenme indükler ve protein tirosin fosforilasyonunu değiştirir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td>
			<td style="width:115px;">K&#38;J Magnetics, Inc</td>
			<td style="width:103px;">DX88-N52</td>
			<td style="width:375px;">grade N52 dimension: 1 1/2&#34; dia. x 1/2&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td>
			<td style="width:115px;">K&#38;J Magnetics, Inc</td>
			<td style="width:103px;">D84PC-BLK</td>
			<td>grade N42 dimension: 1/2&#34; dia. x 1/4&#34; thick Black Plastic Coated&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dynabeads M280 Tosylactivated</td>
			<td style="width:115px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:103px;">14203</td>
			<td>superparamagnetic beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:115px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:103px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fibronectin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">F1141-5MG</td>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Apo-Transferrin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">T1428-50MG</td>
			<td>Bovine Apo-Transferrin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:103px;">31966-021</td>
			<td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60*15 mm culture dish</td>
			<td style="width:115px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

Mechanosensitive hücre yüzeyi yapışma kompleksleri hücreler ortamda mekanik özellikleri duyu sağlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalar adhezyon bölgelerinin kuvvet algılayıcı molekülleri, ve soy spesifik gen ekspresyonunu düzenleyen ve fenotipik çıktıları sürücü kuvveti bağımlı transkripsiyon faktörlerini belirledik. Ancak, biyokimyasal yollar içine mekanik gerilim dönüştürme sinyal ağları yakalanması zor kalmıştır. hücre yüzey reseptörüne uygulanan mekanik gerilim ile yapan sinyal yollarını araştırmak için, süperparamanyetik mikroboncuklar kullanılabilir. Burada hücre yüzeyi yapışma proteinlerine kuvvetleri uygulamak için, manyetik boncuklar kullanılarak bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, ligand kaplı boncuklara bağlı yapışma kompleksleri manyetik izolasyonu ile, sadece bir güç bağımlı çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar ile sitoplazmik sinyal yollarını ancak yapışma biçimlenme araştırılması mümkündür. Bu protokol ligand-co hazırlanmasını içermektedirated Süperparamanyetik boncuklar ve uygulama biyokimyasal analizler takip gerilme kuvvetleri tanımlar. Ayrıca, integrin tabanlı yapışma uygulanan gerilimin gösteren verilerin temsili numune yapışma biçimlenme tetikler ve protein tirozin fosforilasyonu değiştirir sağlar.

Tekniğin şematik Şekil 1a&#39;da gösterilmektedir. Ligand konjugasyon sonra, manyetik boncuk 20 dakika için hücreler ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra, kalıcı bir mıknatısın, çeşitli zaman miktarı için yaklaşık 30-40 pN gerilme kuvvetleri uygulamak için kullanılır. Şekil 1b MRC5 hücre yapışma reseptörlerine bağlanan 2.8 um FN-kaplı manyetik boncuklar gösterir. Hücre Parçalama işleminden sonra Süperparamanyetik boncuk yı...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Teşhis Araçları Geliştirmek İçin Mikro-Elektro-Mekanik Sistemler (MEMS)

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...