Name: pancreatic duct infusion: an effective and selective method of drug and viral delivery
Uploaded: 2021-09-30T13:00:00
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Gli autori non hanno riconoscimenti. I finanziamenti sono stati ricevuti dalla Foundation of Health and Family Planning Commission della provincia di Zhejiang (Grant 20146242) e dalla Foundation of Wenzhou Science & Technology Bureau (Grant Y20140248).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la ricerca e la cura degli animali presso l'Ospedale pediatrico di Pittsburgh e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh.
1. Preparazione preoperatoria
<ol><li>Somministrare isoflurano per via inalatoria (1 - 3% per il mantenimento e fino al 5% per induzione) attraverso un cono nasale ad un livello anestetico appropriato. Monitorare l'adeguatezza dell'anestesia con il ...

<ol>
	<li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas:+a+comprehensive+review.">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+evidence+for+in+vitro+dedifferentiation+but+rare+proliferation+of+mouse+pancreatic+beta-cells.">Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).</li><li>Raper, S. E., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+in+vivo+gene+transfer+and+expression+in+normal+rat+pancreas.">Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas.</a> Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cell+tracing,+lineage+tagging+and+targeted+genetic+manipulations+in+multiple+cell+types+using+pancreatic+ductal+infusion+of+adeno-associated+viral+vectors+and/or+cell-tagging+dyes.">Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes.</a> Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+regulates+beta+cell+proliferation+in+adult+mice.">EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice.</a> J Biol Chem. 291 (43), (2016).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+macrophages+promote+beta-cell+proliferation+by+up-regulation+of+SMAD7.">M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).</li><li>Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+acute+biliary+pancreatitis+induced+by+retrograde+pancreatic+duct+infusion+of+Na-taurocholate.">A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate.</a> Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).</li><li>Lichtenstein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury+in+two+experimental+models+of+acute+pancreatitis:+infusion+of+saline+or+sodium+taurocholate+into+the+pancreatic+duct.">Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct.</a> Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).</li><li>Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+acute+biliary+pancreatitis+induced+by+retrograde+infusion+of+bile+acids+into+the+mouse+pancreatic+duct.">Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct.</a> Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).</li><li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transduction+and+labeling+of+pancreatic+ducts+by+targeted+recombinant+viral+infusion+into+mouse+pancreatic+ducts.">Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts.</a> Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin3+activation+is+not+sufficient+to+direct+duct-to-beta+cell+transdifferentiation+in+the+adult+pancreas.">Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas.</a> J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).</li></ol>

Questo lavoro descrive in dettaglio la metodologia alla base dell'infusione del dotto pancreatico, un modello murino efficace per la consegna di geni e altre molecole in modo specifico ed efficace al pancreas. L'ambiguità nelle specifiche della procedura tra i vari gruppi ha evidenziato la necessità di un protocollo standardizzato8,9,10.
Ci sono diversi passaggi critici della procedura, a partire da...

Il pancreas è un organo bifunzionale, con componenti sia endocrini che esocrini. Un certo numero di patologie possono affliggere il pancreas, tra cui diabete, pancreatite e cancro al pancreas1. Tutte e tre queste malattie segnano aree di studio attive, non solo per sviluppare una terapia immediata, ma anche per comprendere meglio la loro fisiopatologia.
Un metodo di somministrazione terapeutica mirato sarebbe utile. Abbiamo sviluppato una tecnica di infusione del dotto pancreatico che è un metodo efficace e selettivo per la somministrazione di farmaci e virus alle cellule pancreatiche. In questo modello, il dotto pancreatico è selettivamente cannulato e il dotto biliare comune è occluso, consentendo la consegna esclusivamente al pancreas.
Questa tecnica può consentire il tracciamento del lignaggio di specifici tipi di cellule per chiarire ulteriormente le vie di sviluppo importanti per lo sviluppo pancreatico e la patologia2,3. Diversi promotori nei vettori virali consentono il targeting specifico delle linee cellulari e l'introduzione di geni in queste linee cellulari4,5. Questo lavoro dimostra l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del pancreas dopo l'infusione del dotto pancreatico di un vettore virale che esprime GFP rispetto a un intervento chirurgico fittizio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Mice (25-30g, 8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:171px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Ketofen</td>
			<td style="width:171px;">Henry Schein Inc.</td>
			<td style="width:137px;">5487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Ethanol (70%)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">34923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:288px;">Sterile Saline Solution</td>
			<td style="width:171px;">Baxter Healthcare Corp.</td>
			<td style="width:137px;">2B-13-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Protective Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Nair or trimmer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Gauze Pads 2in x 2in</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:137px;">22-362-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:288px;">Needles (30.5G and 25G)</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dicksinson and Co.</td>
			<td style="width:137px;">305106 and 305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:288px;">Syringe for Ketofen and Saline</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dicksinson and Co.</td>
			<td style="width:137px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Syringe for Pump</td>
			<td style="width:171px;">Henke Sass Wolf</td>
			<td style="width:137px;">4010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:288px;">Infusion Pump</td>
			<td style="width:171px;">Pump Systems Inc.</td>
			<td style="width:137px;">NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:288px;">Infusion Catheter</td>
			<td style="width:171px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:137px;">CMF31G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Curved Bulldog Clamps (2)</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:137px;">RS-7439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Arruga Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:137px;">RS-5163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Adson Forcep</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:137px;">RS-5234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:288px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td>RS-7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:288px;">Scissor</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td>RS-5982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:288px;">Cotton Tip Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Physician Sales and Services</td>
			<td>22-9988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Suture</td>
			<td style="width:171px;">Owens and Minor</td>
			<td>SXMD1B402</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic duct infusion: an effective and selective method of drug and viral delivery

Il pancreas è un organo bifunzionale con componenti sia endocrini che esocrini. Un certo numero di patologie possono affliggere il pancreas, tra cui diabete, pancreatite e cancro al pancreas. Tutte e tre queste malattie segnano aree di studio attive, non solo per sviluppare una terapia immediata, ma anche per comprendere meglio la loro fisiopatologia. Ci sono pochi strumenti per promuovere queste aree di studio. L'infusione del dotto pancreatico è una tecnica importante che può consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare. La tecnica richiede l'intricata dissezione della seconda porzione del duodeno e dell'ampolla, seguita dall'occlusione del dotto biliare e dalla cannolazione del dotto pancreatico. Sebbene la tecnica sia tecnicamente impegnativa all'inizio, le applicazioni sono miriadi. L'ambiguità nelle specifiche della procedura tra i gruppi ha evidenziato la necessità di un protocollo standard. Questo lavoro descrive l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del pancreas dopo l'infusione del dotto pancreatico di un vettore virale che esprime GFP rispetto a un intervento chirurgico fittizio. L'infusione e quindi l'espressione è specifica per il pancreas, senza espressione presente in nessun altro tipo di tessuto.

Con la pratica e un'attenta tecnica chirurgica, il tasso di sopravvivenza di questi topi dovrebbe essere superiore al 95%. Una settimana dopo l'infusione, l'effetto desiderato dovrebbe essere evidente nel pancreas. I topi a 10-12 settimane di età sono stati utilizzati per le infusioni del dotto pancreatico. Qui usiamo un sierotipo 8 del virus adeno-associato (AAV8) con un promotore CMV per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP), rispetto a un intervento chirurgico fittizio. I pan...

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Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

L'infusione del dotto pancreatico è una tecnica importante che può consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare. Qui viene presentata una tecnica di infusione del dotto pancreatico per la somministrazione di farmaci e virali alle cellule pancreatiche.

Infusione del dotto pancreatico: un metodo efficace e selettivo di somministrazione di farmaci e virus

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

L'obiettivo generale di questa procedura di infusione del dotto pancreatico è quello di consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare nel pancreas. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave sulle malattie che colpiscono il pancreas, tra cui pancreatite cronica, diabete e cancro al pancreas. Per iniziare, posiziona un topo anestetizzato sotto un microscopio sezionante in modo che il suo addome sia posizionato al centro del campo visivo.Immobilizzare l'animale con un nastro chirurgico e quindi applicare un unguento oftalmico ai suoi occhi per evitare che si secchino. Quindi, coprire l'addome del mouse con uno spesso strato di crema per la depilazione. E dopo circa tre minuti, pulire delicatamente la crema con una garza imbevuta di etanolo al 70% per rimuovere tutti i capelli.Infine, pulire la pelle con etanolo al 70%, seguita da una soluzione di ioduro di povidone al 10% per rimuovere eventuali contaminanti e disinfettare la pelle. Per iniziare l'intervento chirurgico, creare con un bisturi un'incisione cutanea della linea mediana che si estende dal processo xifoide all'ombelico. Quindi, usando la pinza Adson, sollevare il peritoneo e fare con le forbici un piccolo foro della linea mediana.Espandere il taglio lungo la linea mediana del peritoneo in modo che la sua lunghezza sia uguale alla lunghezza dell'incisione cutanea. Quindi, utilizzare divaricatori smussati per tirare su il fegato e dopo aver esposto il dotto biliare comune, bloccarlo con un morsetto vascolare bulldog curvo. Identificare il duodeno e con la pinna Arruga, estrarlo caudalmente per visualizzare la papilla visibile come una macchia bianca sulla superficie anteriore della seconda porzione del duodeno.Per identificare il dotto pancreatico, prelevare il duodeno caudalmente, quindi posizionare un ago di calibro 30-1/5 tangenzialmente al duodeno e fare una puntura sulla sua parete che si trova direttamente di fronte alla papilla. Per infondere la soluzione, introdurre il catetere collegato a una pompa di infusione attraverso la duodenotomia creata e farlo scorrere lungo il condotto fino a quando non è visibile all'interno del vaso, ma raggiunge non più di un centimetro per evitare di bypassare affluenti duttali minori. Immobilizzare il catetere bloccandolo con un secondo morsetto vascolare bulldog curvo.Quindi accendere la pompa per avviare l'infusione di 150 microlitri della soluzione nel condotto. Quindi, iniettare al peritoneo del topo circa 1,5 millilitri di soluzione salina per evitare qualsiasi perdita di volume infuso e quindi coprire l'intestino esposto con una garza inumidita per prevenire l'essiccazione. Una volta completata l'infusione, rilasciare il catetere immobilizzato e utilizzando il morsetto bulldog, rimuoverlo delicatamente dal dotto pancreatico.Quindi rilasciare il morsetto dal dotto biliare comune. Chiudere il peritoneo e la pelle suturandoli continuamente in un unico strato e somministrare la prima delle due dosi di analgesico, la seconda delle quali verrà somministrata il giorno successivo. Quindi riportare il topo in una gabbia posizionata sotto una lampada di calore e fornire all'animale cibo e acqua ad libitum.Osservare il topo fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente manifestata in reclinenza sternale. Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, l'accisa dal pancreas animale eutanasizzato e dalla milza, dal fegato e dal duodeno che fungono da controlli. Immergere tutti i tessuti isolati in una soluzione di paraformaldeide al 4% e fissarli a quattro gradi Celsius durante la notte.Una volta fissati i tessuti, crio proteggere i campioni immergendoli in una soluzione di saccarosio al 30% a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo una protezione criomio durante la notte, congelare i campioni in azoto liquido e, utilizzando un microtomo, tagliare le sezioni di tessuto a sei micrometri. Infine, immagina le sezioni al microscopio fluorescente.Qui sono presentate immagini microscopiche di sezioni di pancreas asportati da topi sette giorni dopo un intervento chirurgico fittizio e l'infusione del dotto pancreatico di AAV8 che trasporta il gene GFP. Il fegato, la milza e il duodeno isolati dal topo infuso con AAV8 non hanno mostrato alcun segnale GFP mentre il pancreas ha rivelato un'espressione GFP prominente, confermando la consegna specifica del pancreas del virus dopo infusione del dotto pancreatico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 minuti se eseguita correttamente.Durante l'esecuzione di questa procedura, è molto importante eseguire un'attenta dissezione e realizzare la più piccola duodenotomia possibile per l'introduzione del catetere. Dopo il suo sviluppo, la tecnica ha spianato la strada ai ricercatori che studiano il pancreas per indagare su una serie di patologie che affliggono l'organo, tra cui pancreatite cronica, diabete e cancro al pancreas sia nei roditori che nei modelli animali più grandi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come infondere in modo efficace e selettivo il dotto pancreatico.

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