Name: modeling ovarian cancer multicellular spheroid behavior in a dynamic 3d peritoneal microdevice
Uploaded: 2017-02-18T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por Hong Kong Research Conselho Grant (subsídios 17.122.014, C1013-15G, 719813E, e 17.304.514). AST Wong é um receptor da Croucher Senior Research Fellowship.

1. Projeto de dispositivos microfluídicos e Fabricação <ol><li> Design Master microfluídico <ol><li> Concepção e desenhar o padrão de canal microfluídico com qualquer software de desenho assistido por computador (CAD). NOTA: Normalmente, o desenho CAD pode ser enviado para uma empresa fotomáscara para produzir a foto-mascara. O design de microfluidos consiste em três canais paralelos idênticos, cada um com as seguintes dimensões: 4 mm x 25 mm x 250 m (largura x comprimento x altura) e ajustou 2 mm e...

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics.">Global cancer statistics.</a> CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Met+overexpression+contributes+to+the+acquired+apoptotic+resistance+of+nonadherent+ovarian+cancer+cells+through+a+cross+talk+mediated+by+phosphatidylinositol+3-kinase+and+extracellular+signal-regulated+kinase+1/2.">c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2.</a> Neoplasia. 12, 128-144 (2010).</li><li>Ksiazek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion:+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin.">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li><li>Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinked+Fibrin+Derivatives+and+Fibronectin+in+Ascitic+Fluid+from+Patients+with+Ovarian-Cancer+Compared+to+Ascitic+Fluid+in+Liver-Cirrhosis.">Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis.</a> Thromb Res. 35, 53-64 (1984).</li><li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion.">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307, 58-62 (2005).</li><li>Chang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+cycle+arrest+induced+by+shear+stress:+Roles+of+integrins+and+Smad.">Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).</li><li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+driving+force+for+change:+interstitial+flow+as+a+morphoregulator.">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).</li><li>Rizvi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+induces+epithelial-mesenchymal+transition,+cellular+heterogeneity+and+biomarker+modulation+in+3D+ovarian+cancer+nodules.">Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).</li><li>Ip, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemness+and+chemoresistance+in+epithelial+ovarian+carcinoma+cells+under+shear+stress.">Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress.</a> Sci. Rep. 6, 26788 (2016).</li><li>Avraham-Chakim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-flow+induced+wall+shear+stress+and+epithelial+ovarian+cancer+peritoneal+spreading.">Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading.</a> PloS one. 8, e60965 (2013).</li><li>Burkhalter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+mechanobiology+and+metastatic+success+in+epithelial+ovarian+cancer.">Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer.</a> Faseb Journal. 26, (2012).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+assessment+of+three-dimensional+cell+aggregation+in+rotating+wall+vessel+bioreactors+in+vitro.">Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).</li><li>Ismadi, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+characterization+of+a+spinner+flask+for+induced+pluripotent+stem+cell+culture+application.">Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application.</a> PloS one. 9, e106493 (2014).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PloS one. 9. 9, e89966 (2014).</li></ol>

Este ensaio oferece um modelo flexível e fisiologicamente relevante que podem ser incorporados com vários ensaios bioquímicos e à base de células, incluindo, mas não se limitando a, ensaios de adesão, testes de eliminação mesoteliais, e o rastreio de drogas. Ele pode ser aplicado para a avaliação do efeito do microambiente intraperitoneal na progressão do cancro. No entanto, várias condições experimentais pode necessitar de ser optimizado, dependendo dos objectivos do projecto (por exemplo, o nú...

<html> O câncer de ovário é o câncer ginecológico mais letal e é caracterizada pela disseminação peritoneal generalizada e a formação de ascite maligna 1. Esta extensa metástase peritoneal representa um grande desafio clínico e está associado com resultados clínicos pobres. Ao contrário da maioria carcinomas sólidos que metastatizam através do sangue, cancro do ovário divulga primariamente dentro da cavidade peritoneal. As células tumorais existir como agregados multicelulares / esferóides durante o processo de metástase 2. O facto de a cultura em suspensão pode enriquecer cancro de células estaminais /-iniciação do tumor dos ovários sugere ainda que estes esferóides podem estar associados tanto com a agressividade do tumor e reforçada quimiorresistência 3, 4. Existem diferenças na resposta à droga entre 2D e 3D culturas, o que presumivelmente têm mecanismos moleculares diferentes 5. _content &quot;&gt; A interacção essencial com o mesotélio constrói o microambiente primária para a progressão do tumor do ovário. Estas células mesoteliais encontram-se em uma matriz extracelular (ECM), onde a fibronectina é um constituinte ubíqua. A ligação entre a expressão aumentada de fibronectina derivada de células de mesotélio e a progressão do tumor foi demonstrada. a fibronectina é abundantemente presentes em ascite maligna 6, 7. células de cancro do ovário são também capazes de induzir a secreção de fibronectina a partir de células mesoteliais, a fim de promover o início de metástases do cancro do ovário 8. Emergentes evidência mostra que estímulos mecânicos, incluindo tensão de cisalhamento, pode modular a morfologia celular, a expressão do gene, e, por isso, os fenótipos de células tumorais 9, 10, 11. Como ascite maligna desenvolver e acumulam-se durante tumor progressão, as células do tumor dos ovários são expostos ao fluxo de fluido e a tensão de corte resultante. Uma série de grupos, o nosso incluídos, têm demonstrado o impacto da tensão de cisalhamento na progressão do câncer de ovário, incluindo modificações do citoesqueleto, transições epitelial-a-mesenquimal e stemness câncer de 12, 13, 14, 15. Assim, um microambiente fisiologicamente relevante é importante para a investigação de metástase de tumor peritoneal. No entanto, correntes in vitro sistemas de cultura hidrodinâmicos têm limitações no que imita e controlar uma constante, baixa, o stress fisiologicamente relevante de corte 16, 17, 18, 19. In vitro convencional aproxima-se de focagem em ambos o ambiente celular ou mecânica ainda são limitadas emimitando a complexidade do microambiente intraperitoneal com relevância fisiológica adequada. Aqui, a fim de engendrar um novo modelo do peritoneu para ultrapassar as limitações das estratégias convencionais e para avançar no estudo do compartimento intraperitoneal na metástase do cancro, uma plataforma de microfluidos à base de 3D com o fluxo de fluido controlado foi concebido. Neste modelo, os esferóides de cancro do ovário foram co-cultivadas com células peritoneais humanas primárias mesoteliais em chips de microfluidos sob fluxo contínuo de fluidos (Figura 1A). As células mesoteliais foram plaqueadas em fibronectina. Não aderentes esferóides de cancro do ovário foram semeadas em canais de microfluidos com meio de fluxo contínuo perfundidos por uma bomba de seringa. Tanto o ambiente 3D e as forças mecânicas dinâmicas são factores muito importantes da cascata metastática. Esta plataforma pode ser usado para investigar o microambiente intraperitoneal em termos de cel complexolular ea co-cultura interacções, bem como no que diz respeito a estímulos mecânicos dinâmicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer</td>
			<td>#1196</td>
			<td>100mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2075 photoresist&#160;</td>
			<td>Microchem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer&#160;</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>108-65-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch&#160;</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>SCI</td>
			<td>BB31695-PE/5</td>
			<td>0.86mm (inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Longer precision pump&#160;</td>
			<td>&#160;LSP01-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31100-035</td>
			<td>Add 2.2g/L sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 105 Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30068.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin human</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-chloromethylfluorescein diacetate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td>Green CMFDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling ovarian cancer multicellular spheroid behavior in a dynamic 3d peritoneal microdevice

O câncer de ovário é caracterizada por extensa metástase peritoneal, com esferas de tumor comumente encontrados nas ascite maligna. Isto é associado com resultados clínicos pobres e carece actualmente de um tratamento eficaz. Tanto o ambiente tridimensional (3D) e as forças mecânicas dinâmicas são factores muito importantes nesta cascata metastática. No entanto, culturas de células tradicionais não conseguem recapitular esse microambiente do tumor natural. Assim, os modelos in vivo -como que pode emular o ambiente intraperitoneal são de importância óbvia. Neste estudo, uma nova plataforma de microfluidos do peritoneu foi criado para simular a situação de esferóides de cancro do ovário na cavidade peritoneal durante a metástase. esferóides de cancro do ovário gerados sob uma condição não-aderentes foram cultivadas em canais microfluidicos revestidas com células mesoteliais peritoneais submetidas a uma tensão de cisalhamento fisiologicamente relevante. Em resumo, este mic câncer de ovário mesotélio 3D dinâmicaplataforma rofluidic pode proporcionar novos conhecimentos sobre a biologia básica do câncer e servir como uma plataforma para o potencial de despistagem de drogas e desenvolvimento.

Usando este protocolo, uma plataforma microfluídica foi criada para modelar esferóides cancro do ovário com células mesoteliais em condições hidrodinâmicas. células mesoteliais peritoneais humanas primárias foram cultivadas na microdispositivo durante 16 horas e observadas sob um microscópio de campo brilhante. Como mostrado na Figura 2A, a parte inferior de canal com sucesso foi coberto com uma monocamada de HPMC. É importante notar que a formação de bolhas...

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Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Para estudar a progressão do tumor do ovário num modelo fisiologicamente relevante, esferóides multicelulares foram cultivadas num microdispositivo sob fluxo de fluido simulado. Este modelo 3D dinâmica emula o ambiente intraperitoneal com os componentes celulares e mecânicas onde ocorre a metástase do cancro do ovário.

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Research

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