Name: treatment of ligament constructs with exercise-conditioned serum: a translational tissue engineering model
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00
Duration: 8 min 3 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa post-dottorale NSERC (DWDW), da una borsa di studio ARCS Foundation (AL) e da una UC Davis College of Biological Sciences (KB).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il presente manoscritto descrive un modello di tessuto del legamento che è una utile piattaforma sperimentale per gli investigatori con un ampio spettro di argomenti di ricerca, dal sviluppo del tessuto alle questioni di traduzione / clinica. Il modello di legamento progettato qui descritto si basa su un protocollo versatile che può essere adattato in vari punti durante il flusso di lavoro ( figura 1 e sezione discussione ). Inoltre, la natura intrinsecamente riduzionistica dell&#39;ambiente in vitro può essere avvicinata al reame fisiologico integrando i supporti di alimentazione con siero umano o animale condizionato. I costrutti possono essere formati utilizzando fibroblasti provenienti da una varietà di fonti Mentre la metodologia ei risultati rappresentativi mostrati qui si basano sull&#39;utilizzo di fibroblasti ACL primari, il protocollo di isolamento cellulare può essere regolato per la raccolta di altri tipi di fibroblasti primari. Come descrittoNella figura 4 , i legamenti progettati con cellule primarie isolati da giovani donatori umani mostrano una scarsa variabilità dei donatori. Le cellule primarie sono limitate dall&#39;isolamento iniziale e dalla limitazione del passaggio; L&#39;uso di linee cellulari può migliorare la riproducibilità degli esperimenti. L&#39;utilizzo di altri tipi di cellule può richiedere modifiche nei supporti di coltura cellulare e nella formulazione del fibrino. Ad esempio, abbiamo osservato che le cellule staminali mesenchimali umane (MSCs) non sono in grado di formare tessuti lineari tra gli ancoraggi di cemento brushite durante il corso di 2 settimane mentre i fibroblasti di tendine flessori digitali superiore del cavallo, le cellule stromali del midollo osseo equino, , E MSC murini C3H10T1 / 2 rapidamente contraggono e digeriscono il gel fibrinico per formare un tessuto lineare (osservazioni inedite). Questo contrasto può essere una conseguenza delle differenze nella contrattilità cellulare, nella proliferazione e nella produzione di enzimi fibrinolitici. Applicazione chimicaE stimolazione meccanica Nel metodo descritto qui, i tessuti a base di fibrina si formano intorno agli ancoraggi di cemento brushite, permettendo l&#39;applicazione di stimolazione meccanica tramite un bioreattore di stretching 11 , nonché per il test di trazione a fine punto. La presenza di un&#39;interfaccia del tessuto molle softite (enthesis) presenta inoltre un&#39;opportunità per ulteriori approfondimenti e miglioramenti 22 , 26 (vedi sezione Applicazioni cliniche sotto). In questo ambiente in vitro , il contributo di fattori chimici e meccanici può essere facilmente identificato; Un esempio di questo è mostrato nella Figura 5 , in cui l&#39;effetto dell&#39;ambiente di siero dopo l&#39;esercizio è stato separato dagli stimoli meccanici dell&#39;esercizio fisico. Possono essere necessari studi pilota per determinare la durata degli interventi sperimentali, la composizione dei trattamenti e gli endpoint appropriati per aspettarsi un cambiamento osservabile. foAd esempio, nello studio di siero 1 dopo l&#39;esercizio, la durata del trattamento sperimentale è stata limitata dalla fornitura di siero utilizzato per il completamento dei supporti, da cui i costrutti sono stati alimentati ogni secondo giorno. Inoltre, durante la seconda settimana di coltura, i mezzi di coltura sono stati completati con siero di riposo o post-esercizio con acido ascorbico e L-prolina mantenuta mentre TGF-β1 è stato rimosso. TGF-β1 è un fattore di crescita pro-fibrotico noto che aumenta nel siero dopo l&#39;esercizio 27 . Pertanto, per evitare di oscurare gli effetti correlati al TGF-β1 del serum post-esercizio, questa citochina non è stata mantenuta nel mezzo di coltura. Questo modello di legamento modificato può essere utilizzato anche per testare l&#39;effetto del tratto meccanico. Grazie all&#39;impiego di grip invertite modellate per tenere le estremità di ancoraggio del cemento brushite (simile al tester di trazione uniaxico rappresentato in Figura 1 ), i bioreattori di stretch possono essere progettati per ospitare<html> Legamenti inerti. Il nostro laboratorio ha utilizzato in precedenza questo modello per indagare la risposta di segnalazione molecolare dei legamenti ingegnerizzati al tratto di trazione uniaxiale in un bioreattore 11 su misura che fornirà una migliore comprensione per il disegno razionale di un paradigma di stirata in vitro o anche, potenzialmente, in vivo Stretch / attività / applicazioni terapeutiche. Valutazione dei legamenti ingegnerizzati Come per la cultura monolayer tradizionale, i costrutti 3D possono essere analizzati per l&#39;espressione genica / proteica; Inoltre, la loro morfologia 3D offre anche l&#39;opportunità di valutare i cambiamenti funzionali e morfologici ei costrutti possono essere mantenuti nella cultura per studi a lungo termine ( Figura 3 ). Mentre i legamenti ingegneristici non sono equivalenti ai legamenti nativi e maturi, essi somigliano allo sviluppo di tendini / legamenti e si comportano in modo analogo al tessuto nativo in risposta alle sostanze nutritive&quot;&gt; 26, fattori di crescita 10 , ormoni 25 e esercizio 11 , 28. Quindi, sebbene sia garantita una cautela prima di fare ampie generalizzazioni da qualsiasi modello in vitro , i risultati dei test di costruzione del legamento possono rivelare o informare un particolare meccanismo fisiologico che altrimenti potrebbe essere Impossibile indagare in vivo. Supplemento di supporti di alimentazione con serum condizionato per un modello flessibile e dinamico con ampie applicazioni Il metabolome del siero umano è un milieu di ~ 4.500 composti compresi, ma non limitati a, glicoproteine, lipoproteine, derivati ​​lipidici, substrati energetici, metaboliti, vitamine, enzimi, ormoni, neurotrasmettitori e una pletora di elementi costitutivi / intermedi. L&#39;ulteriore controllo del metabolome del siero umano in base alle classi composto 29 rivela additiBenefici dell&#39;integrazione del siero sperimentale in esperimenti in vitro. Cioè la maggior parte dei ~ 4500 composti in siero sono idrofobi o derivati ​​da lipidi, sottolineando l&#39;importanza delle proteine ​​leganti per il trasporto / solubilizzazione. Ne consegue che sarebbe quasi impossibile ricomprimere sperimentalmente la dinamica di trasporto composto endogeno, e quindi la biodisponibilità e le interazioni target-target. Pertanto, il siero sperimentale è particolarmente efficace per lo studio di composti notoriamente dipendenti da molecole accessorie per la solubilizzazione, il trasporto, il legame dell&#39;obiettivo e il meccanismo d&#39;azione. Il nostro laboratorio ha un interesse a lungo termine per i benefici sanitari dell&#39;esercizio fisico. L&#39;esercizio migliora la funzione cellulare e l&#39;organo in una varietà di tessuti in tutto il corpo 12 , un effetto che può essere attribuito ad una varietà di fattori (ad es. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorini 15 ,Esosomi 16 , 17 ) che vengono rilasciati nella circolazione sistemica. L&#39;ambiente biochimico post-esercizio riflette i fattori liberati sia dall&#39;ormone ormonale responsivo degli esercizi muscolari dello scheletro che dai fattori che vengono rilasciati come risultato della stimolazione simpatica del sistema nervoso delle ghiandole secretari ( ad esempio , cortisolo e catecolamine dalla ghiandola surrenale 18 e crescita Ormone dall&#39;ipofisi anteriore 19 ). Recentemente abbiamo usato un modello di siero pre- e post-esercizio per indagare gli effetti dell&#39;ambiente biochimico indotto da esercizi su tessuti ingegnerizzati. 1 Mentre rimangono molte importanti questioni di ricerca legate all&#39;esercizio, il modello non è in alcun modo limitato in questo modo. Ad esempio, il siero potrebbe essere ottenuto, da fonti di origine animale o umana, a seguito di interventi dietetici o farmacologici o di diverse categorie di età o di popolazione clinicaS 30 . In questo modo, i composti esogeni o endogeni di interesse saranno presenti nel siero e nel mezzo di trattamento, in quantità biodisponibili e interagiscono con il tessuto bersaglio in concerto con l&#39;ambiente endogeno ( cioè in un contesto più fisiologico). Questo approccio è dinamico poiché è altamente probabile che un determinato intervento eserciti un effetto multi-organo (e multi-composto) e quindi l&#39;ambiente fisiologico sarà co-modificato. Mentre questo approccio presenta alcune sfide, dal momento che molteplici variabili biochimiche sistemiche sono alterate contemporaneamente, è un approccio che può aiutare a superare gli inconvenienti della metodologia sperimentale puramente riduzionista 31 , 32 . Assunti insieme, l&#39;implementazione del siero condizionato con un tessuto in tessuto biomimetico ( in vitro ) può essere utilizzato come strumento per fisiologia, nutrizione e domande di ricerca clinica. <stronG&gt; Le applicazioni cliniche sono numerose Il modello di ingegneria tissutale presentato qui può essere utilizzato per indagare le domande di ricerca anatomiche e cliniche che i tradizionali modelli in vitro non possono. Un legamento o un tendine in vivo contiene una regione di transizione tissutale soft-to-hard chiamata l&#39;enthesis. L&#39;entità, che è vulnerabile a lesioni meccaniche legate alla tensione 33 , può essere studiata in sezione trasversale mediante tecniche di microscopia istochemica e elettronica 22 , 26 . Questa interfaccia unica è doppiamente importante per coloro che hanno una mobilità ridotta o vincolata poiché l&#39;inattività fisica compromette la capacità del tessuto connettivo di trasferire il carico a regioni di bassa o alta conformità 34 , portando in ultima analisi una diminuzione complessiva della conformità dei tessuti e un aumento del rischio di lesioni. Il nostro laboratorio ha recentemente utilizzato questo modello di ingegneria tissutale 25 &lt;/ Sup&gt; per modellare un&#39;altra popolazione, atleti di sesso femminile, a rischio di lesioni del tessuto connettivo: l&#39;incidenza di lesioni ACL è circa cinque volte superiore alle loro controparti maschili 35 . I meccanismi potenziali che sostengono questa disparità basata sul sesso nel ferimento sono stati studiati trattando costrutti di legamento con concentrazioni fisiologiche dell&#39;ormone sessuale femminile, estrogeno, a concentrazioni che hanno simulato le fasi del ciclo mestruale. È interessante notare che elevate concentrazioni di estrogeni inibiscono l&#39;espressione e l&#39;attività genica di lysl ossidasi, l&#39;enzima primario responsabile della creazione di cross-links lisina-lisina nella matrice di collagene di legamenti e tendini. Importante, 48 ore di estrogeno alto (per simulare la fase follicolare) diminuiscono la rigidità del costrutto del legamento senza alterare la densità di collagene dei costrutti. Da una prospettiva fisiologica, ciò suggerisce che gli aumenti della lassità del legamento nelle femmine possono essere dovuti, almeno in parte, a diminuireFormazione di crociate. Da una prospettiva sperimentale, questi risultati 25 evidenziano l&#39;utilità del modello di costruzione 3D, che ha permesso l&#39;attività di cross-linking funzionale da esaminare. Da una prospettiva clinica, questo modello può ora essere utilizzato per monitorare rapidamente gli interventi che possono impedire gli effetti negativi dell&#39;estrogeno della funzione del legamento. Commenti finali Qui abbiamo presentato una metodologia dettagliata per la formazione di legamenti ingegnerizzati e la loro utilità come modello 3D in tessuto in vitro . Il modello è altamente adattabile ad una vasta gamma di obiettivi, fornendo flessibilità nel tipo di cellula, negli interventi e nelle misure di risultato di interesse. Supplementare i supporti di alimentazione con il siero condizionato aggiunge un contesto fisiologico che non può essere raggiunto in un ambiente tradizionale in vitro , migliorando la modellizzazione della fisiologia in vivo . In breve, riteniamo che questa sia una modalità di grande portataCon emozionanti implicazioni per l&#39;avanzamento sia dei campi della fisiologia che dell&#39;ingegneria tissutale.

Tendone e lesioni del legamento sono comuni e possono avere effetti debilitanti sulla normale mobilità e qualità della vita. L&#39;intervento chirurgico è spesso necessario, ma può avere successo limitato e variato 4 , 5 . L&#39;attuale concezione di come tendini e legamenti si sviluppano, maturano e rispondono al pregiudizio sono incompleti e pertanto sono necessari modelli di ricerca efficaci per fornire un&#39;idea dello sviluppo di trattamenti più efficaci 5 . Per affrontare questo divario di conoscenze, i modelli animali possono essere usati, ma gli studi in vivo sono intrinsecamente complessi con difficoltà nel controllo dell&#39;ambiente e direttamente destinati ad interventi al tessuto previsto. Al contrario, l&#39;ambiente sperimentale può essere facilmente controllato e monitorato in vitro con la tradizionale cultura cellulare monolayer. Tuttavia, questa tecnica può sovrapplicare l&#39;ambiente chimico e meccanico e pertanto non può recapituareIn ritardo il comportamento in vivo delle cellule. L&#39;ingegneria dei tessuti è in grado di sposare i vantaggi del complesso ambiente in vivo in modelli animali con il controllo dell&#39;ambiente in vitro e fornisce uno strumento aggiuntivo per studiare la fisiologia. Inoltre, armato di una migliore comprensione dello sviluppo del legamento, l&#39;ingegneria tissutale può anche fornire una fonte di tessuto dell&#39;intestino quando è necessaria una ricostruzione chirurgica 6 . Quindi il metodo descritto qui convalida un tessuto 3D progettato in vitro che può essere utilizzato per studiare la funzione del legamento e la morfologia. Strutture a tendine o legamenti a base di fibrina sono stati utilizzati come un modello in vitro per studiare processi fisiologici tra cui la fibrillogenesi 7 del collagene e lo sviluppo del tendine 8 , nonché le applicazioni di traslazione in cui la loro utilità come tessuto graft è stata valutata in un modello di pecora di anterior cruLa ricostruzione del legamento (ACL) 9 . Il nostro laboratorio ha stabilito in precedenza un modello di legamento modificato 3D, che comprende due pennuti, un materiale sostitutivo osseo di fosfato di calcio, ancoranti di cemento. Questo modello può essere sottoposto a diverse condizioni sperimentali semplicemente integrando il mezzo di coltura con fattori biologici 10 o applicando la stimolazione meccanica 11 . Importante, questo modello di legamento osso-osso permette l&#39;analisi approfondita dell&#39;entesi, l&#39;interfaccia tra gli elementi di boney e di sinew, suscettibili di lesioni. Nello studio evidenziato qui per presentare questa metodologia, siamo stati interessati all&#39;effetto dei cambiamenti indotti dall&#39;esercizio nell&#39;ambiente biochimico sulla funzione del legamento. L&#39;esercizio migliora la funzione cellulare e l&#39;organo in una varietà di tessuti in tutto il corpo 2 , 3 , </suP&gt; 12 , un effetto che può essere attribuito al rilascio di varie conosciute (ad es. IL-6 13 , IL-15 14 , 15 esotomi come meteorici, esosomi 16,17 ) e altri fattori bichimici sconosciuti rilasciati nella circolazione sistemica . Inoltre, l&#39;ambiente biochimico post-esercizio è arricchito da ormoni reagenti all&#39;esercizio fisico, il cui rilascio è stimolato dalla stimolazione simpatica del sistema nervoso delle ghiandole secretari ( ad es. , Cortisolo e catecolamine dalla ghiandola surrenale 18 e ormone della crescita dalla pituitaria anteriore 19 ). Tuttavia, in vivo , è impossibile differenziare gli effetti dello stimolo meccanico dell&#39;esercizio da cambiamenti biochimici indotti dall&#39;esercizio fisico. Mentre alcuni studi hanno caratterizzato l&#39;aumento previsto di alcuni ormoni circolanti e citochine in risposta all&#39;esercizioE come sopra accennato, ci sono troppi fattori, sia conosciuti che sconosciuti, per ricapitolare fedelmente in vitro. Cioè, isolare alcuni fattori per uno studio in vitro inadeguato indirizza la complessità della risposta biochimica. In questo studio abbiamo studiato come i cambiamenti nell&#39;ambiente biochimico sierico, causati dall&#39;esercizio fisico, influenzino la funzionalità del legamento ingegnerizzato. Per isolare gli effetti dei cambiamenti biochimici, abbiamo ottenuto il siero dai partecipanti umani prima e dopo un periodo di esercizio di resistenza e usato per trattare i legamenti 3D progettati formando fibroblasti umani crociati anteriori (ACL). Utilizzando questo modello, possiamo ottenere dati funzionali, inclusi effetti sulle proprietà meccaniche e sul contenuto di collagene, nonché quantificare gli effetti sulla segnalazione molecolare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1724">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20</td>
			<td style="width:229px;">Entomoravia</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:896px;">For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-tricalcium phosphate</td>
			<td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For brushite cement anchors; include whether it&#39;s hazardous /toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">o-phosphoric acid, 85% (w/w)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX0995</td>
			<td>For brushite cement anchors; include info on preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275-500g</td>
			<td>For brushite cement anchors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm tissue culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td>For silicone-coated plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>&#160;4019862</td>
			<td>For silicone-coated plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td>For cell isolation and expansion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X antibiotic/antimycotic solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-616</td>
			<td>For cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type II collagenase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17101015</td>
			<td>For cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X penicillin/streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>For cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steriflip-GP, 0.22&#160;&#181;m pore, polyethersulfone, gamma irradiated</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>For reagent sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>For cell and tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BioSera</td>
			<td>FBS2000</td>
			<td>Component of tissue digestion media and growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G Potassium Salt</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>0219453680 - 100 MU</td>
			<td>Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-598</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>For cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>For cell freezing media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>For cell freezing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Vacutainer Red Plastic 10 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>367820</td>
			<td>For human serum collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354221</td>
			<td>For human serum collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thrombin, bovine origin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4648-1KU</td>
			<td>For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &#956;m, aliquot, and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibrinogen, bovine origin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &#956;m, aliquot, and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3428</td>
			<td>For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 &#956;m, aliquot, and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-Aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>07260-100g</td>
			<td>For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 &#956;m, aliquot, and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &#956;m and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5607-25G</td>
			<td>Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &#956;m and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transforming growth factor-&#946;1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer&#39;s instructions at a concentration of 10 &#956;g/mL. Aliquot and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stericup-GP, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 250&#160;mL, radio-sterilized</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>For reagent sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Dilute in water to 6M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Dimethylaminobenzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39070-50g</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramine-T trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402869-100g</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-4-Hydroxy-L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H54409-100g</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>279544-1L</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421-250ml</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluene, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-1L</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-656</td>
			<td>For hydroxyproline assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of ligament constructs with exercise-conditioned serum: a translational tissue engineering model

Gli esperimenti in vitro sono essenziali per comprendere i meccanismi biologici; Tuttavia, il divario tra la cultura del tessuto monolayer e la fisiologia umana è grande e la traduzione dei risultati è spesso scarsa. Pertanto, vi sono ampie opportunità per approcci sperimentali alternativi. Qui presentiamo un approccio in cui le cellule umane sono isolate da residui di tessuto ligamentario crociato anteriore umano, estesi in coltura e utilizzati per formare legamenti ingegnerizzati. L&#39;esercizio fisico altera l&#39;ambiente biochimico nel sangue, in modo da migliorare la funzione di molti tessuti, organi e processi corporei. In questo esperimento, il substrato di coltura del legamento è stato completato con siero umano sperimentale che è stato &quot;condizionato&quot; dall&#39;esercizio fisico. Quindi l&#39;intervento è più biologicamente rilevante in quanto un tessuto sperimentale è esposto all&#39;ambiente pieno biochimico endogeno, comprese le proteine ​​leganti e composti addizionali che possono essere alterati in tandem con l&#39;attività di unAgente sconosciuto di interesse. Dopo il trattamento, i legamenti ingegnerizzati possono essere analizzati per la funzione meccanica, il contenuto di collagene, la morfologia e la biochimica cellulare. Nel complesso, ci sono quattro vantaggi principali rispetto alla cultura monolayer tradizionale e ai modelli animali, del modello fisiologico del tessuto del legamento qui presentato. Innanzitutto, i costrutti del legamento sono tridimensionali, consentendo di quantificare le proprietà meccaniche ( cioè la funzione) come lo sforzo di trazione finale, il carico massimo di trazione e il modulo. In secondo luogo, l&#39;entità, l&#39;interfaccia tra gli elementi di boney e sinew, può essere esaminata in dettaglio e all&#39;interno del contesto funzionale. In terzo luogo, la preparazione di mezzi con il siero di post-esercizio consente di essere studiati in modo imparziale gli effetti dell&#39;ambiente biochimico indotto dall&#39;esercizio, che è responsabile della vasta gamma di benefici per la salute dell&#39;esercizio fisico. Infine, questo modello sperimentale avanza la ricerca scientifica in modo umano ed etico sostituendo l &#39;uso diAnimali, un mandato fondamentale degli Istituti Nazionali di Salute, del Centro per il Controllo delle Malattie e della Food and Drug Administration.

Panoramica della formazione del legamento e degli interventi sperimentali La figura 1 mostra una panoramica della formazione di legamenti progettati. Il cemento brushite, un materiale sostitutivo osseo 22, viene preparato combinando una soluzione di acido ortofosforico / acido citrico con il fosfato β-tricalcico nei pozzetti cilindrici. In alternativa, se non direttamente misurando la funzione meccanica dei tessuti, suture di seta da 3-0 possono essere utilizzate come ancoraggi nella formazione di un tessuto. Questi sono apposti a 12 mm in piastre di 35 mm rivestiti in silicone e sterilizzati con l&#39;aggiunta di etanolo al 70%. I fibroblasti sono isolati da residui di legamento cruciali anteriori ottenuti durante la chirurgia di ricostruzione ACL. Dopo l&#39;espansione, 2,5 x 10 5 cellule sono incapsulate in un gel di fibrina formato nel piatto ancorato a cemento spazzolato. Dopo la formazione, legamento constrPossono essere esaminati per cambiamenti nelle proprietà meccaniche, contenuto di collagene, proliferazione cellulare, espressione genica, livelli proteici e morfologia tissutale. Durante la cultura, le cellule contraggono il gel di fibrina e formano un tessuto lineare tra i due ancoraggi ( Figura 2A ). Dopo 1-2 giorni di coltura, le cellule hanno attaccato al gel di fibrina, processi di cellule estese e hanno cominciato a esercitare forze di trazione ( figura 2B ). Poiché il gel fibrinico è contratto da forze di trazione e suddiviso per enzimi cellulari, viene generata una tensione tra i due punti di ancoraggio e le nostre cellule allineano parallelo a questo asse ( Figura 2B ) e cominciano a depositare il collagene. Dopo 4-5 giorni, i costrutti si sono contratti intorno agli ancoraggi che formano un tessuto cilindrico lineare ( figura 2A , a questo punto stimoli esterni possono essere applicati al sistema (intervEntion in questo momento evita di interrompere il processo di formazione dei tessuti lineari). Gli interventi possono consistere nel completamento del mezzo di coltura con siero umano o animale dopo un dato intervento, citochine esogene e fattori di crescita, impiegando stimolazione meccanica o cambiando altri fattori ambientali come la tensione dell&#39;ossigeno. Utilizzando mezzi di crescita (DMEM con 10% FBS e 100 U / mL penicillina) integrati con acido ascorbico 200 μM, 50 μM L-prolina e 5 ng / mL TGF-β1, abbiamo determinato che la proliferazione cellulare continua per tutta una cultura di 2 settimane Infatti, la microscopia leggera rivela un tessuto densa contenente cellule altamente allineate a 14 giorni di coltura ( Figura 2B ). Valutazione dei legamenti ingegnerizzati Alla fine del periodo di coltura, i legamenti progettati possono essere valutati in una varietàY di modi. Un importante vantaggio di questo sistema è la capacità di determinare le modifiche funzionali al tessuto attraverso test meccanici, una valutazione vitale data il ruolo meccanico del legamento nativo. Il test di trazione uniaxial può essere utilizzato per misurare le proprietà meccaniche, compreso il carico all&#39;insufficienza, la resistenza alla trazione e il modulo Young. Le proprietà viscoelastiche possono anche essere misurate con il rilassamento dello stress e le prove di creep. La figura 3A illustra un legamento costruito in appositi manicotti stampati in un tester a trazione uniaxial su misura. La presa giusta è attaccata ad un trasduttore di forza per misurare il carico attraverso il legamento in quanto il tessuto è teso al guasto. La figura 3B mostra una trama rappresentativa dello stress-strain per una prova di guasto. Dopo essere stati sottoposti a prove meccaniche, gli stessi costrutti possono essere essiccati e trattati per un test di idrossiprolina 23 per valutare il contenuto totale del collagene e altri biocheSaggi micali. Con un numero sufficiente di campioni aggiuntivi per condizione, può essere condotto un approfondito esame di un intervento sperimentale, inclusi i suoi effetti sulla proliferazione cellulare, sull&#39;espressione di geni e proteine ​​e sulla morfologia istologica. Mentre 14 giorni è un endpoint tipico per i nostri studi, i legamenti ingegneristici continuano a migliorare nelle loro proprietà meccaniche e nel contenuto di collagene attraverso 28 giorni di coltura come mostrato nella Figura 3C e possono sopravvivere per almeno 3 mesi nella cultura 24 . La variabilità dei donatori è una considerazione importante per la ripetibilità sperimentale. La figura 4 mostra un esperimento rappresentativo riportato da Lee et al. 25 confrontando 7 donatori ACL diversi (n = 3 maschi e n = 4 femmine) che dimostrano caratteristiche tipiche di tensione e contenuto di collagene dopo una cultura di 2 settimane nelle precedenti<html> Mezzi di crescita integrati. Utilizzando le cellule da raccolte ACL simili, l&#39;età del donatore, il tempo dopo lesioni, il sesso, ecc., I legamenti progettati dimostrano una scarsa variabilità tra donatori e caratteristiche simili tra donatori maschi e femmine, ad eccezione della differenza nella frazione di collagene. Nello studio sopra citato, i legamenti ingegnerizzati sono stati utilizzati come un modello in vitro per indagare perchè le donne presentano un rischio significativamente maggiore di lesioni ACL rispetto agli uomini e hanno dimostrato che i fibroblasti ACL isolati dai donatori femminili non formano intrinsecamente legamenti ingegnerizzati meno collagene 25 . L&#39;impatto dell&#39;ambiente serico dopo l&#39;esercizio sulla funzionalità del legamento in vitro Abbiamo dimostrato in precedenza la capacità dei legamenti ingegnerizzati di sondare i processi fisiologici 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 25. Nel seguente esperimento rappresentativo riportato da West et al. 1 , abbiamo determinato gli effetti biochimici dell&#39;esercizio sulla funzione del legamento e mettere in evidenza la metodologia ei risultati qui. Abbiamo formato legamenti ingegnerizzati utilizzando cellule ACL umane e applicato un intervento, al giorno 7 della cultura, costituito da supporti di coltura condizionati con siero umano raccolti prima o dopo l&#39;esercizio fisico. In breve, abbiamo reclutato giovani partecipanti maschii sani e raccoglievano campioni di sangue prima e dopo un esercizio acuto di esercizi di resistenza che aumenta gli ormoni circolanti e le citochine tra cui l&#39;ormone della crescita umana (GH). Il siero umano è stato isolato dai campioni di sangue pre- e post-esercizio e utilizzato in sostituzione del siero fetale fetale nel mezzo di coltura per la seconda settimana di coltura del legamento progettato ( figura 5A ). I campioni di siero pre- e post-esercizio sono stati analizzati usando ELISA per cambiamenti nel GH e fattore di crescita 1 (IGF-1) come l&#39;insulinaLa cui concentrazione può essere alterata dall&#39;esercizio ( figura 5B ). Queste informazioni sono state utilizzate per correlare gli effetti del siero sui legamenti progettati con cambiamenti nel siero in risposta all&#39;esercizio fisico. Dopo un periodo di coltura di 14 giorni, i costrutti del legamento sono stati valutati usando test meccanici e determinazione di idrossisprolina del contenuto di collagene e hanno dimostrato un significativo aumento sia del carico massimo di trazione che del contenuto di collagene in risposta al siero post-esercizio. Allo scopo di valutare se questo effetto fosse correlato a emissioni indotte da GH o IGF-1, i legamenti ingegnerizzati sono stati formati in un esperimento separato e trattati con una risposta dose di GH o IGF-1 ricombinante umano. È interessante notare che, mentre il siero GH aumentava nel sangue ( Figura 5B -i), aumentando progressivamente la concentrazione ricombinante di GH nei campioni di coltura non aumentava il contenuto di collagene ( Figura 5D -i)Proprietà (dati non mostrati) in legamenti progettati. Al contrario, i livelli di siero IGF-1 non aumentano dopo l&#39;esercizio, ma un esperimento di risposta dose ha rivelato che i livelli crescenti nei supporti di coltura migliorarono il contenuto di collagene dei costrutti di legamento ( Figura 4D -ii). Così, mentre l&#39;esercizio ha portato ad un forte aumento dell&#39;attività post-esercizio GH, l&#39;esperimento di dose-risposta usando rhGH solleva dubbi sul fatto che GH sia direttamente responsabile della valorizzazione fenotipica dei legamenti ingegnerizzati (almeno l&#39;isoforma 22 kDa da solo Sembrano essere responsabili). Viceversa, mentre il siero IGF-1 non è stato alterato a 15 minuti dopo l&#39;esercizio, il test rhIGF-1 su una vasta gamma di concentrazioni ha rivelato che IGF-1 è in grado di migliorare il contenuto di collagene; Tuttavia, va notato che aumentando le concentrazioni di rhIGF-1 attraverso un intervallo che i livelli stimati fisiologici non aumentano significativamente il contenuto di collagene. Quindi, l&#39;unico enviro del siero post-esercizioNm era importante per migliorare la meccanica e il collagene dei legamenti ingegnerizzati. Nello studio evidenziato qui 1 , il volume del siero sperimentale era limitato a causa di considerazioni etiche; Quindi, i bioassay a breve termine a 2D, che avevano esigenze più basse del siero, sono state utilizzate per sondare ulteriormente i meccanismi molecolari responsabili dell&#39;aumento del collagene osservato. I fibroblasti ACL sono stati coltivati ​​a confluenza in piastre a 6 pozzetti e trattati per 1 ora con riposo o dopo l&#39;esercizio siero e confrontati con le reazioni di dose di GH ricombinante, IGF-1, TGF-β1 e l&#39;attivazione di bersagli nel PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2 e Smad sono stati determinati. In presenza di un siero post-esercizio, il percorso PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2 ha mostrato una maggiore attivazione stimata dalla fosforilazione di S6K ( Figura 5D -i) e ERK1 / 2 ( Figura 5D -ii) rispettivamente.Rispetto alle risposte della dose di ormone e della citocina, mentre GH ha avuto un piccolo effetto positivo sulla segnalazione mTOR ( Figura 5D -i) e IGF-1 ha mostrato un effetto positivo alla dose più bassa, i tre trattamenti di GH, IGF-1 e TGF -β1 non ha rappresentato l&#39;aumento del segnale PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2. Considerati insieme, il nostro modello di legamento 3D e 2D bioassay suggeriscono che l&#39;ambiente di siero dopo l&#39;esercizio è in grado di migliorare la funzionalità del legamento e il contenuto di collagene mediante l&#39;attivazione dei percorsi PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2. In sintesi, utilizzando un modello di legamento ingegneristico combinato con un siero esercitato con condizionamento, siamo riusciti a i) studiare l&#39;effetto dell&#39;ambiente di siero dopo l&#39;esercizio sulla funzione del legamento e del collagene ingegneristico, ii) correlare le variazioni nel fenotipo del legamento con le concentrazioni dell&#39;ormone serico, Con l&#39;obiettivo di determinare quali cambiamenti nel siero hanno portato a changIii) aggiustare l&#39;ambito del lavoro utilizzando bio-analisi 2D per sondare obiettivi molecolari del milieu biochimico serico per determinare meccanismi molecolari che sono attivati ​​da post-esercizio serum che portano a miglioramenti nella funzione del legamento. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica della formazione e utilizzo dei legamenti progettati. Gli ancoraggi di cemento Brushite sono fabbricati e fissati in piastre rivestite con silicone. I fibroblasti primari sono isolati ed espansi dai residui ACL. I legamenti progettati sono formati mediante incapsulamento dei fibroblasti in un gel di fibrina attorno a due ancoranti di cemento brushite. I legamenti progettati vengono coltivati ​​e trattati con qualsiasi stimolo chimico o meccanico specifico ( ad esempio , tramite un bioreattore) desiderato. Al punto finale desiderato, i legamenti progettati possono essere raccolti e valutati per meccanicaL proprietà, espressione genica, contenuto di collagene, espressione proteica e istologia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> Figura 2. I fibroblasti del legamento primario costituiscono un legamento artificiale osso-osso basato su fibrina che comprende due ancoranti di cemento brushite. ( A ) Nel tempo, i fibroblasti contrappongono il gel di fibrina intorno agli ancoraggi di cemento brushite che formano un tessuto lineare. Nei primi tre giorni le cellule si collegano al gel di fibrina e esercitano forze di trazione, allineando le cellule con l&#39;asse lungo del costrutto. Oltre 14 giorni, le cellule formano un tessuto altamente allineato. Barra di scala = 160 μm. ( C ) Il contenuto del DNA dei legamenti progettati continua ad aumentare oVer 14 giorni nella cultura come le cellule proliferano. I dati sono presentati come media ± SD con n = 3-4 costruzioni per gruppo. gruppi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> Figura 3: Le proprietà meccaniche del legamento e del collagene sono migliorate nel tempo. ( A ) I costrutti del legamento sono testati in modo uniaxially tensile per determinare l&#39;effetto di un dato intervento sulla funzione del legamento. Come mostrato, due impugnature stampate in rilievo, stampate in rilievo, sono dotate di ancore a forma di reciprocità, che sono colmate dal sinistro progettato. Gli ancoraggi sono accoppiati ad un motore passo-passo e trasduttore di forza per generare curve stress / tensione del tessuto testato, consentendo di determinare proprietà meccaniche. ( B &lt;/ Strong&gt;) Rappresentante curva di stress-strain da un legamento ingegnerizzato teso al fallimento. Nel corso di 28 giorni, la resistenza alla trazione massima (UTS), ( D ) il carico massimo di trazione (MTL), ( E ) il modulo Young e la frazionazione di collagene continuano a migliorare. I dati sono presentati come media ± SD con n = 5 costruzioni per gruppo. * Indica una differenza significativa da tutti gli altri gruppi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> Figura 4: I legamenti progettati possono essere valutati per funzionalità e contenuto biochimico, mostrando una scarsa variabilità dei donatori. I legamenti progettati sono stati formati 7 donatori diversi (n = 3 maschi, n = 4 femmine). Dopo 2 settimane o( C ), ( D ) area trasversale (CSA), ( E ) contenuto totale di collagene per Costruire, e ( F ) collagene come una frazione di massa secca. I dati sono presentati come media ± SD e la significatività statistica è stata con il t-test di Student. * Indica una differenza significativa da altri gruppi (p &lt;0,05). Figura adattata da Lee et al. 25 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> Figura 5. I legamenti progettati dimostrano cambiamenti meccanici e biochimici in risposta al bioloGli interventi gicali. ( A ) Il siero è stato isolato dai raccolti di sangue raccolti da soggetti pre- (RestTx) e post-esercizio (ExTx) e usato per trattare i legamenti ingegnerizzati durante la seconda settimana di cultura. ( B ) (i) L&#39;ormone della crescita umana (GH) e (ii) i livelli di fattore di crescita dell&#39;insulina (IGF) -1 nel resto e nel siero di esercizio sono stati quantificati mediante ELISA. ( C ) I legamenti progettati trattati con ExTx hanno dimostrato un miglioramento (i) del contenuto di collagene e (ii) il carico massimo di trazione. La significatività statistica dei confronti accoppiati (RestTx e ExTx) è stata analizzata mediante un t-test con livello di significato impostato a p &lt;0,05. ( D ) Una risposta dose-risposta di (i) GH e (ii) IGF-1 è stata utilizzata per determinare i possibili contributi di questi fattori ai cambiamenti nel contenuto di collagene dovuti a ExTx. E) I bioassays 2D sono stati utilizzati per confrontare gli effetti di dosi crescenti di GH, RestTx e ExTx su obiettivi di segnalazione molecolare come la fosforilazione di (i) S6K Thr389 e (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . Il confronto statistico di più di due gruppi sperimentali è stato eseguito utilizzando l&#39;AND e l&#39;HSD di Tukey. I dati sono presentati come presentati come media ± SD. * Indica una differenza significativa dal controllo (p &lt;0,05) e § indica differenza significativa da 150 ng / mL e 300 ng / mL IGF-1. Figura adattata da West et al. 1 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

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