Name: multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Unterstützt durch die NIH / NIDA DA034783. Wir danken Bryan A. Killinger für technische Unterstützung bei der Multimer-PAGE.

1. Gewebepräparation <ol><li> Herstellung von 10 ml der 4-fach BN-PAGE-Probenpuffer (200 mM Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v Glycerin, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). HINWEIS: Diese Stammlösung im Voraus und bei 4 ° C durchgeführt werden kann. </li><li> Verdünnte 250 ul 4x Probenpuffer in 750 &amp; mgr; l dH 2 O , enthaltend 1x kommerziellen Protease - Inhibitor - Cocktail. Vortex und Chill auf Eis. </li><li> Homogenisiert 20 mg des Zielgewebe...

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für jede Aufgabe Lebewesen auszuführen. Aus diesem Grunde sind sie Gegenstand intensiver Prüfung und Forschung. Multimer-PAGE ist ein neues Verfahren für die Erfassung, trennt, und eine Vielzahl von Proteinkomplexen zu analysieren. Wir haben bereits gezeigt , seine Anwendbarkeit oligimerization des krankheitsassoziierten Protein α-Synuclein 11 bis zu studieren. Jedoch ist es dehnbar zu vielen Proteinkomplexen, wie in Abbildung 2 ...

<html> Normale zelluläre Funktion ist abhängig von Protein-Protein - Wechselwirkungen 1, 2. Als Ergebnis werden menschliche Krankheiten , die oft durch Störungen in der Montage und Verhalten verschiedenen Proteinkomplexe 3 markiert. Die Fähigkeit, solche Interaktionen zu charakterisieren, ist daher von entscheidender Bedeutung. Aktuelle Mittel, um diese Wechselwirkungen zur Detektion erfordern Reinigung von Zielproteinen, die oft durch Pull-Down ihrer Interaktionspartner gefolgt. Herkömmliche Reinigung wird durch differentielle Zentrifugation, Präzipitation durchgeführt, und / oder Chromatographie 4. Diese Verfahren sind zeitaufwendig, muss für jedes Zielprotein verändert werden, und führen oft zu geringen Ausbeuten. Moderne Reinigungsverfahren umfassen die Fusion von Peptid - Tags an Zielproteine, durch Immunpräzipitation oder Extraktion auf Säulen , gefolgt mit Perlen zu einem Einfang - Moleküle gebunden 5 geladen wird ,„&gt; 6. Während dieses erweiterbaren viele Proteine ist, erfordert es Sequenzmodifikation des Ziels, möglicherweise in Konstrukten führt , die für ihre üblichen Bindungspartner in der Affinität unterscheiden. Die empfindliche Natur einiger Protein-Protein - Wechselwirkungen , bedeutet dieses Verfahren nicht anwendbar sein kann viele Szenarien. Außerdem ist das Pull-down-Assays verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen abbilden kann keine genaue zelluläre Bild erfassen, aufgrund eingeschränkter Freiheitsgrade und nicht-nativen Mengen des Köders Proteins. Idealerweise Proteinkomplexe könnten zur Reinigung oder Pull-Down ohne die Notwendigkeit, in ihren Heimatstaat nachgewiesen werden. Blau nativen Polyacrylamid - Gelelektrophorese (BN-PAGE) wurde als weniger denaturierende Alternative zu Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) entwickelt und erlaubt die Trennung von einigen Proteinen und Komplexen aus biologischen Proben 7. Eine getrennte Proteine ​​in BN-PAGE auf Basis eines LARge Anzahl von Variablen, einschließlich der Größe, Ladung, dreidimensionale Struktur, und die Assoziation mit anderen Molekülen. Die Wechselwirkungen dieser Faktoren führen häufig in Zusammenarbeit Trennung von Proteinen, die Aggregatbildung und schlechter Proteinbande Auflösung. Zweidimensionale nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese löst einige, aber nicht alle dieser Probleme 8. Um die Komplikationen zu umgehen mit nativer Trennung verbunden sind , verwenden einige Autoren aminreaktive Vernetzungsreagenzien, wie Dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), Proteinkomplexe in Gewebelysaten 4 zu erfassen. Diese behandelten Lysate können dann durch SDS-PAGE denaturiert und abgetrennt werden, während die native Größe und Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu erhalten. Da jedoch die Vernetzungsreagenzien auf die Nähe von einem Molekül zum anderen auf Basis reagieren und Proteine ​​in Gewebe-Lysaten haben viele Freiheitsgrade und kann stochastisch interagieren, nicht-spezifischen Hintergrund Quer-Verknüpfung kann in konzentrierten Proben hoch, vor allem sein. Dies kann schwierig zu interpretierenden Ergebnissen führen zu. Hier stellen wir die Verwendung eines Hybrid-BN-PAGE / SDS-PAGE-Verfahren zeigen, bezeichnet als Multimer-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Multimer-PAGE), zu trennen, und das Protein Baugruppen in komplexen Mischungen zu erfassen. Anfänglich wird Zelllysat in Polyacrylamidgel über BN-PAGE suspendiert. Das Lysat enthaltende Gel wird dann mit dem Vernetzungsreagenz DSP. Pseudo-immobilisierte und leicht auf dem Gel aufgetrennt, Proteine ​​sind viel weniger wahrscheinlich unspezifisch zu reagieren, was bedeutet, Hintergrund Vernetzers Reaktivität verringert wird. Nach der Vernetzung werden die Gel-Banden ausgeschnitten und mittels SDS-PAGE getrennt. Das resultierende Gel kann dann durch ein beliebiges Mittel typischerweise mit Polyacrylamidgelelektrophorese assoziiert analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung und den Nachweis von nativen Proteinkomplexen in unmodifizierter Gewebelysat, ohne die Notwendigkeit für eine zusätzliche Reinigung oder Pull-Down.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemicals</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">&#949;-Aminocaproic acid</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">164855000</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0148</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Anti rabbit IgG-HRP from goat</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bicinchoninic acid assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bis-tris</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Butanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemiluminescence substrate kit</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Coomassie blue G-250</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Digitonin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dithiobis(succinimidylpropionate)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry nonfat milk</td>
			<td style="width:195px;">LabScientific</td>
			<td style="width:119px;">M0841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycine</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144SI-212</td>
			<td>For titration. Caustic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Methanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-4</td>
			<td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Monoclonal anti &#945;-synuclein IgG from rabbit</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-7011-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">16479</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">NP40</td>
			<td style="width:195px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polysorbate 20 (tween-20)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">SDS solution (10% w/v)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L37771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tricine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris base</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Name</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">GE Imagequant LAS 4000</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9558-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:195px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Synergy H1 microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Gel Former + Stand</td>
			<td style="width:195px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">2 mL dounce homogenizer</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ultrasonic tissue homogenizer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB120220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

Es gibt viele gut entwickelte Methoden zur Reinigung und einzelne Proteine ​​und Peptide zu studieren. Allerdings sind die meisten zellulären Funktionen von Netzwerken interagierender Proteinkomplexen durchgeführt, die oft schwierig zu untersuchen, da ihre Bindung nicht-kovalent und leicht durch Reinigungstechniken gestört. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung und Trenn native Protein-Komplexe aus nicht-veränderten Geweben zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von. Tissue-Lysat wird auf eine nicht-denaturierenden blau-native Polyacrylamidgel geladen, dann wird ein elektrischer Strom angelegt wird, bis das Protein, das eine kurze Strecke in das Gel wandert. Die Gelstreifen die migrierten Protein enthält, wird dann mit den aminreaktiven Vernetzungsreagenz Dithiobis (succinimidylpropionat), das kovalent Protein ausgeschnitten und inkubiert Komplexe stabilisiert. Die Gelstreifen vernetzten Komplexe enthalten, werden dann ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel eingegossen, und tEr komplexe sind vollständig getrennt. Die Methode beruht auf Techniken und Materialien, die den meisten Molekularbiologen vertraut sind, was bedeutet, dass es kostengünstig und leicht zu erlernen ist. Während es in seiner Fähigkeit, äußerst große Komplexe adäquat zu trennen, begrenzt ist und nicht allgemein erfolgreich war, war die Methode in der Lage, eine Vielzahl von gut untersuchten Komplexen zu erfassen und ist wahrscheinlich auf viele interessierende Systeme anwendbar.

In dieser Demonstration Experiment wurde Multimer-PAGE auf ganzem Rattenhirn-Lysat durchgeführt. Die resultierenden getrennten Proteine ​​wurden auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen geblottet und dann mit Antikörpern gegen Proteine ​​untersucht, die Komplexe sind dafür bekannt, zu bilden. Abbildung 1 zeigt eine Validierung des Protokolls durch zwei Mittel. Erstens, zeigen wir , dass die vernetzten Proteine durch Zugabe eines Reduktionsmittels abspaltbar...

Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Forschung

Biochemie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...