Name: multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Sostenuto dalla DA034783 NIH / NIDA. Ringraziamo Bryan A. Killinger per l&#39;assistenza tecnica con il multimero-PAGE.

1. Preparazione del tessuto <ol><li> Preparare 10 ml di 4x tampone campione BN-PAGE (200 mM Bis (2-idrossietil) ammino-tris (idrossimetil) metano (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v di glicerolo, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). NOTA: Questa soluzione madre può essere effettuato in anticipo e conservato a 4 ° C. </li><li> Diluire 250 ml di tampone campione 4x in 750 microlitri dH 2 O contenente 1x commerciale cocktail di inibitori delle proteasi. Vortex e freddo sul ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare 20 m...

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. 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interazioni proteina-proteina sono importanti per ogni compito esseri viventi svolgono. A causa di questo, sono oggetto di intenso scrutinio e di ricerca. Multimero-PAGE è un nuovo metodo per l&#39;acquisizione, la separazione e l&#39;analisi di un&#39;ampia gamma di complessi proteici. Abbiamo precedentemente dimostrato la sua applicabilità a studiare oligimerization della malattia associata proteina α-sinucleina 11. Tuttavia, è estendibile a molti complessi proteici, come mostrato nella <st...

<html> Funzione cellulare normale dipende da interazioni proteina-proteina 1, 2. Come risultato, malattie umane sono spesso caratterizzate da perturbazioni nel montaggio e il comportamento di vari complessi proteici 3. La capacità di caratterizzare tali interazioni è quindi cruciale. attuali mezzi di rilevamento di queste interazioni richiedono purificazione di proteine ​​target, spesso seguite da discesa dei loro partner interagenti. Purificazione convenzionale viene realizzata mediante centrifugazione differenziale, precipitazione e / o cromatografia 4. Questi metodi richiedono tempo, devono essere modificati per ogni proteina bersaglio, e spesso sfociano in basse rese. I moderni metodi di purificazione comporta la fusione di tag peptidici di proteine bersaglio, seguita da immunoprecipitazione o estrazione su colonne carichi di perline legati ad una molecola di cattura 5,&quot;&gt; 6. Mentre questo è estensibile per molte proteine, richiede sequenza modificazione del bersaglio, causando un potenziale costrutti che differiscono affinità per loro soliti partner di legame. La delicatezza di alcune interazioni proteina-proteina significa che questo metodo non può essere applicabile per molti scenari. Inoltre, i saggi di pull-down utilizzati per mappare le interazioni proteina-proteina possono non catturare un quadro preciso cellulari, a causa di gradi di libertà e limitato i livelli di non-native della proteina esca. Idealmente, complessi proteici possono essere rilevati nei loro stati native, senza la necessità di depurazione o di pull-down. Blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è stato sviluppato come meno denaturante alternativa sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), e consente la separazione di alcune proteine e complessi da campioni biologici 7. Tuttavia, le proteine ​​in BN-PAGE separate basate su una larnumero ge di variabili, tra cui le dimensioni, carica, struttura tridimensionale, e associazione con altre molecole. Le interazioni di questi fattori causano spesso co-separazione delle proteine, formazione di aggregati, e scarsa risoluzione banda proteica. Elettroforesi bidimensionale nativo-poliacrilammide risolve alcuni, ma non tutti, questi problemi 8. Per aggirare le complicazioni associate con separazione nativo, alcuni autori utilizzano reagenti ammina reattiva reticolanti, come ditiobis (propionato succinimmidil) (DSP), per catturare complessi proteici in lisati di tessuto 4. Questi lisati trattati possono essere denaturate e separate mediante SDS-PAGE, preservando la dimensione originale e il trucco complessi proteici. Tuttavia, poiché i reagenti reticolazione reagiscono in base alla vicinanza di una molecola a un&#39;altra, e le proteine ​​nei lisati tissutali avere molti gradi di libertà e può stocasticamente interagire fondo non specifica croceIl legame può essere elevato, soprattutto nei campioni concentrati. Ciò può portare a risultati difficili da interpretare. Qui dimostriamo l&#39;utilizzo di un metodo ibrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominato elettroforesi multimer-poliacrilammide (multimer-PAGE), per separare e rilevare gruppi di proteine ​​in miscele complesse. Inizialmente, il lisato cellulare viene sospeso in gel di poliacrilamide tramite BN-PAGE. Il gel contenente lisato viene quindi reagito con il reagente di reticolazione DSP. Pseudo-immobilizzato e leggermente separato sul gel, le proteine ​​sono molto meno probabilità di reagire in modo non specifico, il che significa che la reattività di cross-linker di sfondo è ridotta. Dopo la reticolazione, le bande di gel vengono escise e separate mediante SDS-PAGE. Il gel risultante può quindi essere analizzato con qualsiasi mezzo tipicamente associato all&#39;elettroforesi del gel di poliacrilammide. Questo metodo consente la separazione e la rilevazione di complessi proteici nativi in ​​lisato tissutale non modificato, senza la necessità di ulteriori purificazione o tiraturan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemicals</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">&#949;-Aminocaproic acid</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">164855000</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0148</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Anti rabbit IgG-HRP from goat</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bicinchoninic acid assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bis-tris</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Butanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemiluminescence substrate kit</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Coomassie blue G-250</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Digitonin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dithiobis(succinimidylpropionate)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry nonfat milk</td>
			<td style="width:195px;">LabScientific</td>
			<td style="width:119px;">M0841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycine</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144SI-212</td>
			<td>For titration. Caustic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Methanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-4</td>
			<td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Monoclonal anti &#945;-synuclein IgG from rabbit</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-7011-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">16479</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">NP40</td>
			<td style="width:195px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polysorbate 20 (tween-20)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">SDS solution (10% w/v)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L37771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tricine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris base</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Name</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">GE Imagequant LAS 4000</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9558-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:195px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Synergy H1 microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Gel Former + Stand</td>
			<td style="width:195px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">2 mL dounce homogenizer</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ultrasonic tissue homogenizer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB120220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

Ci sono molti metodi ben sviluppati per purificare e studiare singole proteine ​​e peptidi. Tuttavia, la maggior parte delle funzioni cellulari sono svolte da reti di interazione complessi proteici, che sono spesso difficili da studiare perché il loro legame non covalente e facilmente perturbato da tecniche di purificazione. Questo lavoro descrive un metodo per stabilizzare e separare complessi proteici nativi da tessuto non modificato usando elettroforesi bidimensionale poliacrilammide. Tessuto lisato viene caricato su un gel di poliacrilammide-blu nativa non denaturante, quindi una corrente elettrica viene applicata fino a quando la proteina migra a breve distanza nel gel. La striscia gel contenente la proteina migrato viene poi asportato e incubato con le ditiobis ammina reattiva reticolanti reagenti (succinimidil propionato), che stabilizza covalentemente complessi proteici. La striscia gel contenente complessi reticolati viene poi gettato in un gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato, e tegli complessi sono separati completamente. Il metodo si basa su tecniche e materiali noti alla maggior parte dei biologi molecolari, che significa che è poco costoso e facile da imparare. Mentre è limitato nella sua capacità di separare adeguatamente estremamente grandi complessi, e non è stato universalmente successo, il metodo è stato in grado di catturare una vasta gamma di complessi ben studiato, ed è probabile applicabile a molti sistemi di interesse.

In questo esperimento di dimostrazione, multimero-PAGE è stata eseguita su tutto il lisato cervello di ratto. Le proteine ​​risultanti separati sono stati trasferiti su di polivinilidene (PVDF) diflouride membrane, e poi incubate con anticorpi contro le proteine ​​che sono noti per formare complessi. La figura 1 mostra una convalida del protocollo in due modi. In primo luogo, abbiamo dimostrato che le proteine reticolate sono scindibile mediante aggiunta di un a...

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Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Ricerca

Biochimica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...