Name: multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Поддерживается DA034783 NIH / NIDA. Мы благодарим Брайан А. Киллингера за техническую помощь с мультимерами-ПААГОМ.

1. Подготовка ткани <ol><li> Подготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для образцов (200 мМ бис (2-гидроксиэтил) амино-трис (гидроксиметил) метан (Bis-Tris), 200 мМ NaCl, 40% вес / объем глицерина, 0,004% Ponceau S, рН 7,2 ). Примечание: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и хранили при 4 ° С. </li><li> Разбавляют 25...

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

Белок-белковые взаимодействия являются важными для каждой задачи живых существ выполнять. Из-за этого, они являются предметом пристального внимания и исследования. Мультимер-страница представляет собой новый способ для захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплек...

<html> Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий , 1, 2. В результате болезнь человека часто отмечается возмущениями в сборке и поведении различных белковых комплексов 3. Способность характеризовать такие взаимодействия Поэтому крайне важно. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требует очистки белков-мишеней, часто с последующим раскрывающихся их взаимодействующих партнеров. Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографически 4. Эти методы требуют больших затрат времени, должны быть изменены для каждого белка-мишени, и часто приводят к низким выходам. Современные методы очистки включают слияние пептидных тегов белков - мишеней, а затем с помощью иммунопреципитации или экстракции на колонках с грузом шариков , связанных с молекулой захвата 5,«&gt; 6. Хотя это является расширяемым для многих белков, это требует модификации последовательности мишени, что потенциально приводит к конструкции , которые отличаются по сродству для своих обычных партнеров связывания. Деликатный характер некоторых белок-белковых взаимодействий означает , что этот метод не может быть применят для многих сценариев. Кроме того, выпадающие анализы, используемые для сопоставления белок-белковых взаимодействий может не захватывать точную клеточную картину, из-за ограниченных степеней свободы и неместных уровней белка приманки. В идеале, белковые комплексы могут быть обнаружены в их родных штатах, без необходимости очистки или тянуть вниз. Синий нативный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-БН) была разработана в качестве менее денатурирующего электрофореза альтернативы натрия додецилсульфата в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а также позволяет для разделения некоторых белков и комплексов из биологических образцов 7. Однако белки в BN-PAGE с отдельной на основе LARGE число переменных, включая размер, заряд, трехмерную структуру, и ассоциации с другими молекулами. Взаимодействие этих факторов часто приводит к совместному разделению белков, образованию агрегатов, и плохого разрешению полосы белка. Двумерный электрофорез нативной полиакриламидном геле устраняет некоторые, но не все из этих проблем 8. Для того, чтобы обойти осложнения , связанные с нативным разделением, некоторые авторы используют аминные-реактивные сшивающие реагенты, такие как дитиобис (сукцинимидилпропионат) (DSP), чтобы захватить белковые комплексы в лизатах ткани 4. Эти обработанные лизаты могут быть затем денатурируют и разделяют с помощью ДСН-ПААГ, сохраняя при этом родной размер и состав белковых комплексов. Однако, так как поперечно-сшивающие реагенты реагируют на основе близости от одной молекулы к другой, а также белков в лизатах ткани имеет много степеней свободы, и может взаимодействовать стохастический, неспецифический фон крест-linking может быть высоким, особенно в концентрированных образцах. Это может привести к трудным для интерпретации результатов. Здесь мы демонстрируют использование способа гибридного БН-PAGE / SDS-PAGE, названный мультимера-электрофорез в полиакриламидном геле (мультимер-PAGE), для разделения и обнаружения белковых агрегатов в сложных смесях. Первоначально, клеточный лизат суспендируют в полиакриламидном геле с помощью BN-PAGE. Лизат-содержащий гель затем подвергают взаимодействию с реагентом DSP сшивания. Псевдо-иммобилизованных и слегка разделенные на геле, белки гораздо реже реагируют неспецифически, а это означает фон кросс-линкер реакционная способность снижается. После сшивания, гель полосы вырезают и разделяли с помощью SDS-PAGE. Полученный гель затем могут быть проанализированы с помощью любых средств, обычно связанных с электрофорезом в полиакриламидном геле. Этот метод позволяет для разделения и обнаружения нативных белковых комплексов в лизате немодифицированной ткани, без необходимости дополнительной очистки или PULL-Дауп.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemicals</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">&#949;-Aminocaproic acid</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">164855000</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:336px;">Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0148</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Anti rabbit IgG-HRP from goat</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bicinchoninic acid assay kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bis-tris</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Butanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A399-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Chemiluminescence substrate kit</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Coomassie blue G-250</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Digitonin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D128-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dithiobis(succinimidylpropionate)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Dry nonfat milk</td>
			<td style="width:195px;">LabScientific</td>
			<td style="width:119px;">M0841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Glycine</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermofisher</td>
			<td>78430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A144SI-212</td>
			<td>For titration. Caustic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Methanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-4</td>
			<td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Monoclonal anti &#945;-synuclein IgG from rabbit</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-7011-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">N,N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">16479</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">NP40</td>
			<td style="width:195px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polysorbate 20 (tween-20)</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ponceau S</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">SDS solution (10% w/v)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L37771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP329-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tricine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris base</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">161-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Name</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">GE Imagequant LAS 4000</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9558-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:195px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Synergy H1 microplate reader</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Gel Former + Stand</td>
			<td style="width:195px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">2 mL dounce homogenizer</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ultrasonic tissue homogenizer</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB120220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

Есть много хорошо разработанных методов для очистки и изучения одиночных белков и пептидов. Тем не менее, большинство клеточных функций осуществляется сетей взаимодействующих белковых комплексов, которые зачастую трудно исследовать, поскольку их связывания не является ковалентной и легко возмущается методами очистки. Эта работа описывает способ стабилизации и разделения нативные белковые комплексы из немодифицированной ткани с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Ткань лизат наносили на неденатурирующем сине-родной полиакриламидном геле, а затем электрический ток подается до тех пор, пока белок мигрирует на короткое расстояние в геле. Полоска геля, содержащая перенесенный белок затем вырезала и инкубировала с дитиобисом аминного реакционноспособным сшивающим реагентов (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полосы гель, содержащий поперечно-сшитые комплексы затем отливают в сульфат полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и третон комплексы разделены полностью. Метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, это означает, что это недорогой и простой в освоении. В то время как он ограничен в своей способности адекватно отделить чрезвычайно крупные комплексы, и не было универсально успешным, метод был в состоянии захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов, и, вероятно, применимо ко многим системам, представляющим интерес.

В этом демонстрационном эксперименте мультимер-PAGE проводили на всем лизате мозга крысы. Полученные в результате этого выделенные белки переносили на поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны, а затем зондировали с использованием антител против белков, которые, ка?...

Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...