Name: isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry
Uploaded: 2017-01-28T14:00:00
Duration: 5 min 38 s
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The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

Os experimentos foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pela Comissão da Investigação Animal da Universidade de Tel Aviv. 1. Isolamento de tecido pancreático de murganhos <ol><li> Para ratos adultos: <ol><li> Preparar o tampão de digestão de: 0,4 mg / mL de colagenase P e 0,1 ng / ml de DNase I dissolvido em Hanks &#39;Solução Salina Equilibrada (SSHE). Recentemente preparar 5 ml de tampão por ratinho em 15 mL tubos cónicos e mantê-los em gelo até à sua utilização. </li><li> Eutanásia os ratos de acordo com a diretriz institucional. </li><li> Dissecar cada rato para remover o pâncreas (para instrução, consulte Referência 18); coloque-o em um prato de cultura contendo HBSS. É possível executar esta fase sob um microscópio estereoscópico, e para aumentar a eficiência da digestão, o tecido cortado em 2 - 4 peças. </li><li> Colocar o tecido pancreático para um tubo contendo tampão digestivo (preparado no passo 1.1.1). Manter os tubos em gelo até que todos os ratinhos são dissecados e os tecidos pancreáticoscoletado. </li><li> Repita os passos 1.1.2 - 1.1.4 com os restantes ratinhos. </li></ol></li><li> Para os embriões e camundongos neonatais: <ol><li> Preparar o tampão de digestão de: 0,4 mg / mL de colagenase P e 0,1 ng / ml de DNase I dissolvido em HBSS. Para os embriões e filhotes no dia pós-natal 7 (P7) ou mais jovens, recém preparar 1,5 - 2 ml de tampão per rato em um tubo cônico de 15 mL. Para P7 ou filhotes mais velhos, preparar 3 - 4 ml de tampão por ratinho num tubo cónico de 15 ml. Manter em gelo até à sua utilização. </li><li> Eutanásia os ratos de acordo com a diretriz institucional. Para os embriões, remova todos os embriões do útero de sua mãe e colocá-los em uma placa de cultura de 10 mm contendo PBS. Dissecar um embrião de cada vez. </li><li> Coloque o mouse sobre as suas costas, com a cabeça apontando para longe do investigador. Usando uma pinça fina, puxe a pele abdominal e aberto na linha média para expor a cavidade abdominal até o diafragma do rato 18. </li><li> Usando uma pinça fina, separar o fígado from a parede abdominal para trás. Com um movimento contínuo para a cauda do rato, para colher os órgãos internos (incluindo o fígado, estômago, baço, intestino, rim e pâncreas) e colocá-los em uma placa de cultura contendo HBSS. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, remover o fígado e os rins para expor o pâncreas (Figura 1). Utilizando finos fórceps, o pâncreas separar a partir do estômago, duodeno, e, finalmente, a partir do baço. </li><li> Colocar o tecido pancreático para um tubo contendo tampão digestivo (preparado no passo 1.2.1). Para p14 ou mais filhotes, cortar o tecido em pedaços para 2 aumentar a eficiência da digestão. Manter os tubos em gelo até que todos os ratinhos são dissecados e os tecidos pancreáticos recolhido. </li><li> Repita os passos 1.2.2 - 1.2.6 com os restantes ratinhos. </li></ol></li></ol> 2. Pâncreas Digestão <ol><li> Incubar os tubos contendo o tecido pancreático (em tampão de digestão) num bloco de aquecimento a 37 ° C durante 30 min com agitatião a 700 rpm. Após 15 minutos, agitar manualmente os tubos invertendo-los 3 - 4 vezes e colocá-los novamente no bloco de aquecimento. NOTA: Se estiver usando um bloco de aquecimento sem capacidades de agitação, inverta os tubos a cada 5 - 10 min. Certifique-se de que o tecido é digerido corretamente. Se não, o tecido cortado em pequenos pedaços antes da incubação ou aumentar a agitação. </li><li> Para parar a digestão do tecido, colocar os tubos em gelo e adiciona-se 10 ml de HBSS frio a cada tubo. Centrifugar os tubos a 4 ° C e 300 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. </li><li> Re-suspensão: <ol><li> Para ratinhos adultos e p14 ou filhotes mais velhos, de re-suspender o sedimento com 6 mL de PBS e coar por meio de um filtro de células de 70 mícrons colocado no topo de um novo tubo de recolha de polipropileno cónico de 15 mL. Para assegurar a máxima recuperação de células, lavar o tubo inicial com um adicional de 6 mL de PBS e coar por o coador de células no tubo de recolha. </li><li> Para os embriões e filhotes mais jovem tHan p14, re-suspender o sedimento com 2 mL de PBS e coar por meio de um filtro de células de 35 mícrons colocado no topo de um tubo de recolha de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (tubo FACS). Para assegurar a máxima recuperação de células, lavar o tubo inicial com um adicional de 2 mL de PBS e coar por o coador de células no tubo de recolha. </li></ol></li><li> Centrifugar os tubos a 4 ° C e 300 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Remover cuidadosamente o líquido, como células são frouxamente ligado ao tubo de poliestireno. </li></ol> 3. Preparação etiquetado células individuais <ol><li> preparações buffer: Para o isolamento de células por FACS, preparar triagem tampão misturando PBS (sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio), 5% de soro fetal de bovino (FBS), e EDTA 5 mM. Para análise de citometria de fluxo, preparar tampão de análise, completando tampão de triagem com 0,05% de azida de sódio. Ambos os tampões podem ser armazenadas a 4-8 ° C durante até 2 meses. </li><li> células na seleção ou ana suspender novamentetampão de lise. Re-suspender cada pâncreas isoladas de embriões e filhotes com menos de p7 em 1 mL, de filhotes entre P8 e um mês de idade em 1,5 mL, e de camundongos com idade superior a um mês, em 3 mL. Estirpe das células através de um coador de células de 35 mícrons colocado no topo de um tubo de poliestireno de fundo redondo (tubo FACS). </li><li> Para a coloração controlos, tirar de 50 a 100 uL alíquotas de amostras feitas na etapa anterior (não mais do que 5% do volume total de amostra) e colocá-los em novos tubos de FACS; incluem um tubo para cada fluoróforo utilizado, incluindo DAPI e proteínas fluorescentes, bem como para um controlo não corado. NOTA: Quando utilizando ratinhos transgénicos com células que expressam uma proteína fluorescente, ou quando o número de células é limitada, incluem um tecido não-transgénico como controlo coloração. Se as células que expressam uma proteína fluorescente são usados ​​sem mais coloração, vá para o passo 3.8. </li><li> Girar-se as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e o sobrenadante aspirado. </li><li> para blocorei, re-suspender as células com solução de bloqueio (100 ul de tampão de análise de triagem ou suplementados com 1 uL de IgG de cabra) e incubar durante 30 min em gelo. </li><li> Para corar marcadores de superfície celular, preparar uma mistura que inclui todos os anticorpos desejados a fluoróforos, em um volume de 100 mL por amostra. Preparar diluições de anticorpos 2x em triagem ou tampão de análise (ou seja, diluir o anticorpo para se obter o dobro da concentração requerida, se uma diluição final de 1: 200 é desejado, diluir o anticorpo a 1: 100). Sem lavagem da solução de bloqueio, adicionar 100 uL da mistura para as células de amostra para se atingir um volume final de 200 de coloração uL. Incubar durante 30-60 minutos em gelo e no escuro. </li><li> Para definir a análise ou de triagem parâmetros (ver passos 4.3 e 5.2), preparar tubos adicionais que contêm apenas um dos anticorpos usados ​​(controle de coloração). Preparar diluições de anticorpos 2x em triagem ou tampão de análise (conforme descrito no passo 3.6). Certifique-se de incluir um sidiluição controlo ngle coloração para cada fluoróforo utilizado, assim como um controlo não corado. Sem lavagem da solução de bloqueio, adiciona-se 100 ul de misturas de anticorpos para as células (preparado no passo 3.3) para se conseguir um volume final de 200 de coloração uL. Incubar durante 30 - 60 min em gelo e no escuro. </li><li> Lavar enchendo cada tubo com a análise ou a triagem de tampão para um volume máximo de 4 mL. Opcionalmente, re-esticar as células através de um coador de células de 35 mícrons (tal como descrito no passo 3.2). </li><li> Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante cuidadosamente. </li><li> Re-suspender as amostras em análise ou classificação buffer. Re-suspender as células isoladas a partir de embriões em 500 ul, de filhotes de menos de um mês de 1 mL, a partir de 1 - 3 meses de idade, em 2 ml, e a partir de ratinhos com mais de 3 meses em 3 ml. controlos de coloração pode ser re-suspenso em 300 ul de tampão. </li><li> Adicionar 200 ng / mL de DAPI para as células re-suspensas para identificar as células mortas. Certifique-se de incluir um co tubontaining células não coradas sem DAPI para as configurações de citómetro. Continuar a separação de células (passo 4) ou análise (etapa 5). </li></ol> 4. celular Sorting <ol><li> preparações: <ol><li> Para separação de células antes da extração do RNA, o revestimento de um tubo de coleta de 1,5 mL com RNase inibidor imediatamente antes da separação. Para este fim, adicionar 1 ml de tampão de triagem, contendo 0,01 U / ml de RNase inibidor, para um tubo estéril de recolha de 1,5 mL. Após 5 min, vortex do tubo e remover o líquido. </li><li> Para separação de células antes da cultura de células, adicionar 3 ml de meio de cultura estéril (Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 20% FBS, 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina-estreptomicina) num tubo estéril de recolha 15 mL . </li></ol></li><li> Antes de colocar um tubo em um classificador FACS, vortex brevemente para voltar a suspender as células. Mantenha os restantes tubos no gelo. </li><li> Comece analisando os controlos de coloração para determinar os parâmetros de classificação (por exemplo, </em&gt; Tensão e compensação) e classificação de portas (por exemplo, a população total de células, células DAPI-negativos ao vivo, e populações de células a serem classificados). </li><li> Uma vez que os parâmetros de classificação e portões são criados, carregar as amostras e iniciar células de classificação para os tubos de coleta. NOTA: A ordenação condições são altamente dependente do instrumento. Nós usamos uma largura de 100 um bico, a uma pressão de 23,1 psi, e uma velocidade máxima de triagem 5. </li><li> Prossiga para a extração de RNA ou a cultura de células classificadas. NOTA: Para a extracção do ARN, centrifugar as células a 2000 xg durante 5 min e remover o líquido em excesso, antes de continuar com um protocolo de extracção padrão. Para a cultura de células, se as células foram classificados em condições não-estéreis, lavar duas vezes através do enchimento do tubo com o meio de cultura e centrifugando-o a 300 xg durante 7 minutos antes da cultura, a fim de minimizar a sua contaminação. </li></ol> 5. A análise das células por citometria de fluxo <ol><li> antes loading cada tubo para o citômetro, vortex brevemente para voltar a suspender as células. Mantenha os restantes tubos no gelo. </li><li> Comece analisando as amostras não coradas e individuais-corados para determinar os parâmetros de análise (por exemplo, tensão e de compensação). </li><li> Uma vez que os parâmetros de análise são criados, carregar cada amostra, incluindo o controle de coloração e registrar os resultados. Analisar os resultados obtidos utilizando citometria de fluxo de software de análise. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aqui, nós descrevemos um método para isolar e analisar as células do microambiente pancreático. Este método pode ser utilizado para isolar células mesenquimais do tecido pancreático embrionário e adulto. Além disso, temos utilizado com sucesso este protocolo para isolar as células endoteliais do adulto e pâncreas neonatal 5, 17. No entanto, pode não ser adequado para a obtenção de uma suspensão de uma única célula reprodutível de células epiteliais pancreáticas (protocolos alternativos são descritos nas referências 18, 23, e 24). Usando este método, as células marcadas fluorescentemente, quer expressando proteínas fluorescentes ou imunocoradas para marcadores de superfície, podem ser purificados por FACS ou analisados ​​por citometria de fluxo. ARN pode ser extraído a partir de células purificadas ao perfil seu padrão de expressão do gene. Alternativamente, as células purificadas podem ser cultivadas para estabelecer uma linha de células para análise proteomic subsequente. Este método permitirá a caracterização de factores expressed pelo microambiente pâncreas, que regem a sua organogênese, fisiologia e fisiopatologia. O mesênquima pancreático suporta organogênese tecido, promovendo a proliferação de precursores e células diferenciadas 5, 9. Estas células foram mostrados para apoiar a expansão de células estaminais embrionárias humanas (hESC) -derived progenitores pancreáticas 17, 25, 26. Portanto, delineando a identidade de factores mesenquimais embrionárias facilitaria esforços actuais para a geração de células beta produtoras de insulina a partir de células induzidas e hESCs pluripotentes estaminais (IPSCs) como uma cura potencial para a diabetes. estudos genéticos de ratinho permitiu a identificação de factores de crescimento, tais como o FGF10, que são produzidos pelo mesênquima para promover a expansão epitélio pancreático durante as fases iniciais do desenvolvimento do pâncreas3, 9. Com o objetivo de identificar fatores adicionais expressos no mesênquima embrionário, foram isoladas destas células usando microdissection capturou-laser, extraído seu RNA, e realizada análise de expressão gênica 26. No entanto, além de ser intensa de trabalho, este método baseia-se na identificação de células com base nas suas características morfológicas, o que restringe a sua utilização para fases do desenvolvimento antes da ramificação do epitélio para o mesênquima envolvente (isto é, E12.5). Para caracterizar células mesenquimais em fases posteriores de desenvolvimento, foi utilizado o método descrito aqui 5, 17. Nós utilizado este método para analisar a expressão de marcadores de superfície por mesênquima pancreático neonatal 5. Além disso, as células mesenquimais foram isoladas a partir de tecido de pâncreas embrionário e neonatal de Nkx3.2 -Cre; ratinhos R26-EYFP, com base emsua marcação fluorescente nesta linha do rato, e foram cultivadas para estabelecer linhas de células 17. A análise de proteómica destas células permitiu a identificação de factores secretados pelo mesênquima pancreática com a capacidade de promover pancreáticas progenitores derivados de células estaminais embrionárias humanas 17. Nós ainda utilizado este método de isolamento de células para purificar células mesenquimais a partir de tecidos pancreáticos adultos para a extração de RNA e expressão gênica análise 17. Por conseguinte, este método pode ser usado para identificar genes e proteínas expressas pelo mesênquima pâncreas, com a capacidade para suportar o desenvolvimento de células do pâncreas. células mesenquimais do pâncreas foram ainda mostrado desempenhar um papel na tumorigénese pâncreas. PDAC é caracterizada pela formação de um estroma desmoplástico rica em fibroblastos constituído por fibroblastos, células do sistema imunológico, e 27 ECM. Enquanto o estroma foi pensado para promover o desenvolvimento de muitostipos de cancro, foi mostrado para conter progressão PDAC 15, 16, 28. Isto sugere que os componentes do estroma pâncreas segregam factores que inibem a tumorigénese. Além disso, as alterações na composição celular do estroma, bem como no fenótipo celular podem estar subjacentes a seu efeito sobre as células epiteliais 15, 16, 28. O método aqui descrito pode, por conseguinte, ajudar na caracterização dos diferentes tipos de células que compõem um estroma PDAC, em comparação com o tecido do pâncreas saudável. Seria ainda permitir a purificação de diferentes tipos de células do estroma para caracterizar as alterações potenciais nos seus perfis de expressão de genes durante a progressão PDAC. No entanto, devido a mudanças na composição da ECM pancreática durante 27 tumorigénese, os ajustes dos parâmetros de digestão do tecido, tais como a inclusão de additional tipos de colagenase ou aumentando o tempo de incubação, pode ser necessária.

homeostase energética e a digestão dos alimentos em mamíferos depende da função pancreática adequada. O pâncreas adulto é composto de dois compartimentos principais celulares: o exócrina e endócrina. Células exócrinas, incluindo as células acinares que produzem e segregam enzimas digestivas e as células do dueto que transportam estas enzimas para o intestino, englobam mais de 80% da massa total de 1 pancreático. Células endócrinas, que incluem células beta produtoras de insulina e células alfa produtoras de glucagon, são organizadas nas ilhotas de Langerhans que são incorporados no tecido exócrina e secretam hormônios para regular os níveis de glicose no sangue 2. Células pancreáticas adquirir seu destino diferenciado através de uma altamente regulada, processo de várias etapas 3. As evidências sugerem que as pistas extrínsecos fornecidas por neuronal, endoteliais e células mesenquimais guiar a diferenciação e proliferação de células do pâncreas em tele embrião 3, 4, 5. Um exemplo é o requisito da aorta para a especificação de precursores pancreáticas primeiros 6. Mais tarde no desenvolvimento, as células endoteliais foram mostrado desempenhar um papel central no desenvolvimento de ambas as células endócrinas e exócrinas pancreáticas e para promover a diferenciação das células beta 4, 6, 7. As células mesenquimais foram mostrados para suportar a sobrevivência e a expansão de células progenitoras comuns pancreáticas, principalmente através da secreção do factor de crescimento FGF10 8, 9. Temos ainda mostrado que estas células apoiar a proliferação de precursores exócrinas e endócrinas, bem como de células diferenciadas incluindo células acinares (e beta) no pâncreas embrionário 5. Recentemente, células mesenquimais foram maismostrado para regular a diferenciação de células endócrinas 10. No adulto, a função de células beta e de massa foram mostrados para depender de células no seu microambiente, incluindo neuronal, imunológico, e células endoteliais, pericitos, bem como 11, 12, 13. Durante lesão, células endoteliais foram mostrados para recrutar células imunes para o pâncreas a promover a replicação das células beta 13. As células endoteliais foram ainda mostrado para produzir componentes de matriz extracelular (ECM) para apoiar a expressão da insulina e da célula beta função 14. Recentemente, demonstrou a necessidade de pericitos das ilhotas para a função das células beta 11. Por fim, as células do estroma pancreático foram mostrados para regular a progressão do adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) 15, 16. No entanto, o identidade de pistas extrínsecos que orientam o desenvolvimento do pâncreas, função e tumorigênese são em grande parte desconhecido. Identificando sinais fornecidos por células do microambiente do pâncreas requer a caracterização dos genes e proteínas expressas por estas células. Isso depende de isolar essas células do pâncreas, a fim de realizar a expressão de genes e análises proteomic e / ou sobre o estabelecimento de linhas celulares. Aqui, propõe-se um método para isolar as células mesenquimais do microambiente pâncreas através da utilização de células de tecido a digestão enzimática e activada por fluorescência (FACS) de células quer imunofluorescência marcados ou células que expressam proteínas fluorescentes. Este protocolo foi realizada com sucesso para isolar e analisar proteína fluorescente amarela (YFP) -expressing células mesenquimais do embrionário, neonatal e adulto pâncreas 5, 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:191px;">11213865001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D5025-15KU</td>
			<td>The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">EDTA</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">01-862-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Goat IgG serum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D8537</td>
			<td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">1.5 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:191px;">72 690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Round Bottom Polystyrene 5 ml tube&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">352008</td>
			<td>FACS tube&#39;. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml tube with 35 &#956;m cell strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">352235</td>
			<td>FACS tube&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:191px;">130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heating block with agitation&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">ThermoMixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:191px;">Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Steromicroscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:191px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:191px;">FACSAria IIu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">flow cytometer</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:191px;">Gallios&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

O mesênquima pancreático é necessária durante o desenvolvimento ea vida adulta. O método descrito aqui permite o isolamento de células mesenquimais do embrionário, neonatal e adulto pâncreas. As células mesenquimais, mas há outros tipos de células, expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) no pâncreas de Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP ratos 5, 11, 17, 19. Durante o desenvolvimento, Nkx3.2 (também conhecido como BapX1) é expressa pelo pâncreas embrionário, estômago, intestino e mesênquima, bem como em um subconjunto de somitos do esqueleto 19, 20, 21. Este gene foi expresso na mesenquima de pâncreas de E9.5 até E11.5, permitindo a expressão do gene sob o controlo de Nkx3.2 -Cre de E9.5 5, </sup&gt; 19, 20. Com base nesta rotulagem, as células podem ser purificadas a partir de tecido pancreático em massa usando citometria de fluxo. A Figura 2 mostra uma análise de citometria de fluxo de células isoladas a partir de tecidos pancreáticos embrionários, neonatais e adultos, isolado como descrito aqui. Considerando que os tecidos pancreáticos não-transgénicos não continham células fluorescentes, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP tecido pancreático de todas as idades analisadas contém uma população de células YFP marcado distinta (Figura 2; marcada com portões). Seguindo o método descrito aqui, as células que expressam proteínas fluorescentes pode ser purificada ou analisados ​​por citometria de fluxo, com ou sem a imunocoloração adicional. Por exemplo, após separação com base na marcação fluorescente, células mesenquimais podem ser cultivadas para estabelecer uma linha de células (por, pelo menos, cinco passagens), como mostrado na Figura 3A. Nota t<html> ele fibrocytic morfologia das células cultivadas, típicos de células mesenquimais. Além disso, este sistema foi usado para analisar a expressão do gene por células separadas. Para este fim, o ARN foi extraído a partir de células mesenquimais ordenados para sintetizar ADNc, e os níveis de expressão de genes foram analisadas por qPCR. Tal análise revelou que as células ordenadas expressar o marcador pan-vimentina mesenquimais (Figura 3B). Finalmente, a expressão do marcador de superfície de células pancreáticas podem ser analisados ​​por citometria de fluxo. Por exemplo, foram isoladas células do tecido pancreático de Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP ratos adultos, usando o método descrito aqui e coradas eles com a superfície da célula glicoproteína CD9, que foi relatado para ser expressa por fibroblastos 22. Como mostrado na Figura 3C, todas as células do Nkx3.2 -Cre fluorescentemente marcado; Pâncreas R26R -YFP expressar CD9. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: tecido pancreático embrionário e neonatal. Tracto gastrointestinal inteiro isolado, incluindo o estômago, baço, intestino, pâncreas e, de um embrião E15.5 (A) e um cachorro P4 (B). O tecido pancreático é demarcada com uma linha azul. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> Figura 2: As células mesenquimais são fluorescente etiquetado em Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP tecido pancreático. Análise de citometria de fluxo de células pancreáticas isoladas a partir de não-transgénico (painéis da esquerda) e Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP transgénico (painéis da direita) ratos em várias idades: embrionário (A), neonatal (B), e adult (C). As células foram analisadas por dispersão lateral (eixo Y) e de fluorescência amarela (eixo x). Portões (marcado com &quot;D&quot;) indicou a presença de uma população de células YFP + em ratinhos transgénicos, mas não nos controlos não-transgénicos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> Figura 3: As análises de células pancreáticas isoladas. (A) células escolhidas a partir do tecido pancreático de Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP ratinhos neonatais (como descrito na Figura 2B) foram cultivadas para estabelecer uma linha de células. As células cultivadas foram fotografadas por fluorescência (verde; direita e painéis à esquerda) e contraste de fase (cinza; painel da direita). (B) diagrama de barras mostrando Vimentin1 (Vim1)Os níveis de expressão de YFP + -sorted células do tecido pancreático de Nkx3.2 -Cre; Ratos adultos R26R -YFP (como descrito na Figura 1C; verde) em comparação com o tecido pancreático não triados (preto). Extraiu-se ARN e a expressão do gene foi analisada por qPCR; expressão foi normalizada para ciclofilina. N = 4. *** P &lt;0,001. Os dados representam a média ± DP. (C) Análise de citometria de fluxo de células pancreáticas dispersos de Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP ratos adultos imuno-coradas com aloficocianina (APC) -conjugated anticorpo anti-CD9 e analisados para a APC (eixo y) e de fluorescência amarela (eixo x). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Aqui, nós descrevemos um processo para o isolamento de células no microambiente pâncreas do rato a partir de tecido embrionário, neonatal e adulto, incidindo sobre o isolamento de células do mesênquima. Este método permite que perfis de expressão gênica celular e secreção de proteínas, a fim de elucidar os sinais extrínsecos que regulam o desenvolvimento pâncreas, função e tumorigênese.

Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

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