Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

العمل الذي كان يموله مجلس البحوث الألمانية (DFG) مع منح لا SFB-938-M و SA 393/3-4.

1-إعداد عموم-الكريات البيضاء
<ol><li>رسم 1 مل دم المحيطي من المانحين صحية (أو المريض) في حقنه هيبارينيزيد. تأكد من الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المسؤولة للتبرع بالدم.</li>
	<li>الدم مع 30 مل من ACK تحلل المخزن المؤقت (4ملم 150 NH Cl و كهكو 1 مم3مم 0.1 يدتا، pH 7.0) في أنبوب 50 مل مل 1 مزيج من الأجهز?...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

تمكين سير العمل المقدمة هنا التحديد الكمي للمناعة نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية (السابقين فيفو) وناقلات الجنود المدرعة. جدير بالذكر أن تفكيك كرات الدم الحمراء عموم الكريات البيضاء استخدمت كمصادر تي خلية، مما يجعل خطوات تنقية تي خلية يمكن الاستغناء عنها. خط خلية سرطان الغدد الل...

خلايا T المنظمين الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ويتم تنشيطها عن طريق الببتيدات مستضدي التي ترد في سياق مجمعات histocompatibility الرئيسية (MHC). يتطلب التنشيط تي خلية كاملة إشارتين، إشارة الكفاءة عن طريق مستقبلات تي خلية محددة مستضد (تكر)/CD3 المعقدة وإشارة كوستيمولاتوري عن طريق مستقبلات التبعي. كلا إشارات يتم إنشاؤها من خلال التفاعل المباشر للخلايا T مع عرض مستضد الخلايا (Apc). ناقلات الجنود المدرعة ناضجة توفر إشارة اختصاص لتنشيط تي خلية عن طريق المجمعات MHC-الببتيد، ويعربون عن يغاندس كوستيمولاتوري (مثل، CD80 أو CD86) لضمان تطور تي خلية التنشيط1. واحدة من الوظائف الهامة كوستيمولاتيون هو إعادة ترتيب أكتين سيتوسكيليتون2،،من34. واو-أكتين القشرية ثابتة نسبيا في استراحة خلايا تي. التحفيز تي خلية عن طريق ناقلات الجنود المدرعة تحمل مستضد يؤدي إلى إعادة ترتيب عميقة cytoskeleton أكتين. ديناميات أكتين (أي الدوائر البلمرة/ديبوليميريزيشن، أكتين سريعة) تمكين الخلايا T لإنشاء القوات التي تستخدم لنقل البروتينات أو العضيات، على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، المهم cytoskeleton أكتين لتطوير منطقة خاصة لاتصال بين خلايا تي وناقلات الجنود المدرعة، تسمى المشبك محصنة. نظراً لأهمية cytoskeleton أكتين المشبك المناعية، فقد أصبح أساسيا لتطوير أساليب لقياس التغيرات في سيتوسكيليتون أكتين تي الخلايا5،6،،من78 , 9.
عن طريق المعونة cytoskeletal أكتين، المستقبلات السطحية والبروتينات مما يشير إلى فصل في مجموعات التنشيط سوبراموليكولار (سماكس) داخل المشبك محصنة. وأكد استقرار المشبك محصنة بربط مستقبلات لحزم واكتين أن زيادة مرونة cytoskeleton أكتين. تشكيل المشبك المناعي قد ثبت أن تكون حاسمة لتوليد الاستجابات المناعية التكيفية. الآثار الضارة لتشكيل المشبك مأمن المعيبة المجراة في تحققت أولاً في المرضى الذين يعانون من ويسكوت ألدريتش متلازمة (WAS)، مرض في بلمرة الأكتين فيها، وفي الوقت ذاته، نشعر بالقلق تشكيل المشبك مأمن10 . وكان يمكن أن المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة وأمراض المناعة الذاتية، الاكزيما والالتهابات الحادة المتكررة. وعلى الرغم من هذا الاستنتاج، حاليا لا يعرف عما إذا كان تشكيل المشبك المناعي يختلف في خلايا تي من الأشخاص الأصحاء والمرضى الذين يعانون من عيوب في المناعة أو أمراض المناعة الذاتية.
مجهرية الأسفار، بما في ذلك [كنفوكل]، TIRF ومجهرية فائقة القرار، استخدمت للكشف عن بنية المشبك محصنة ضد11،12،،من1314. عالية الدقة لهذه النظم وإمكانية أداء تصوير خلية يعيش يتيح جمع المعلومات الدقيقة، والزمانية عن cytoskeleton أكتين والبروتينات السطحية أو داخل الخلايا في المشبك محصنة. ومع ذلك، العديد من النتائج، تستند إلى تحليل سوى بضع عشرات من خلايا تي. وعلاوة على ذلك، يجب تنقية الخلايا T لهذه الأنواع من الأسفار مجهرية. ومع ذلك، للعديد من الأسئلة البحثية، استخدام الخلايا أونبوريفيد بدلاً من هذا القرار أعلى درجة ممكنة أهمية قصوى. وهذا ذات الصلة إذا كان يتم تحليل خلايا تي من المرضى، نظراً لكمية الدم المتبرع به محدودة وقد تكون هناك الحاجة معالجة العديد من العينات في نفس الوقت.
وأنشأنا الطرق المجهرية التي تسمح بتحليل cytoskeleton أكتين في المشبك محصنة في ال16،15،نظام الإنسان17. وتستند هذه الأساليب التصوير التدفق الخلوي، كما دعا في التدفق المجهري18. هجين بين مجهرية متعددة الأطياف التدفق الخلوي والأسفار، التصوير التدفق الخلوي بقوتها في تحليل معلمات المورفولوجية والتعريب البروتين في الخلية غير متجانسة من السكان، مثل عموم-الكريات البيضاء من الدم المحيطي. قدمنا منهجية التي تمكننا من قياس واكتين في تي-خلية/APC يصرف الخلايا البشرية من عينات الدم كله، دون الحاجة إلى خطوات تنقية تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا17. التقنية المقدمة هنا يشمل سير العمل كله، من الحصول على عينة الدم للتحديد الكمي لواو-أكتين في المشبك محصنة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

المشبك المناعي هو مجال الاتصال بين خلايا T وخلايا مستضد-عرض (Apc). استقطاب خلايا تي مستقبلات سطحية والبروتينات نحو المشبك المناعي لضمان ربط مستقرة وتبادل الإشارات. وقد استخدمت مجهرية [كنفوكل]، TIRF، أو دقة فائقة الكلاسيكية لدراسة المشبك محصنة. منذ هذه الأساليب تتطلب الحصول على دليل الصور والقياس الكمي تستغرق وقتاً طويلاً، تصوير الأحداث النادرة الصعبة. هنا، يمكننا وصف سير عمل التي تمكن من تحليل الخصائص المورفولوجية لعشرات آلاف خلايا. هي الناجم عن الاشتباكات العصبية المناعية بين خلايا تي البشرية الأولية في الأعمال التحضيرية لعموم-الكريات البيض وخلايا راجي محملة ب سيب معوي المكوّرات العنقودية الذهبية كناقلات الجنود المدرعة. يتم الحصول على الصور بالتصوير التدفق الخلوي، وتسمى أيضا الفحص المجهري في التدفق، الذي يجمع بين ميزات cytometer تدفق ومجهر الأسفار. تقدم استراتيجية النابضة كاملة لتحديد الخلية T/APC الأزواج وتحليل الاشتباكات العصبية المناعية. كما يقوم سير العمل هذا يسمح تحليل المناعة synapses في الأعمال التحضيرية لعموم أونبوريفيد-الكريات البيض ومن ثم يتطلب سوى كمية صغيرة من الدم (أي، 1 مل)، فإنه يمكن تطبيقها على عينات من المرضى. الأهم من ذلك، عدة عينات يمكن أعدت، وقياسها، وتحليلها بالتوازي.

هدفا رئيسيا للأسلوب الموصوفة هنا هو التقدير الكمي لإثراء البروتين (مثل، واكتين) في المشبك محصنة بين بديلة خلايا تي في عموم أونبوريفيد-الكريات البيضاء المأخوذة من عينات الدم البشري منخفضة الحجم (1 مل) وناقلات الجنود المدرعة (راجي الخلايا). لقطة للشاشة في الشكل 1 </st...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

وهنا يصف لنا سير عمل كاملة للتحليل النوعي والكمي مأمن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية الأولية وتقديم مستضد الخلايا. ويستند الأسلوب التصوير التدفق الخلوي، التي تسمح باكتساب وتقييم عدة آلاف خلية الصور خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن.

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة البشرية، مثل كيفية حدوث التواصل بين الكريات البيض على المستوى الجزيئي والخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل الخلايا التائية البشرية غير المُهَرَّرة في فترة زمنية قصيرة نسبياً. إثبات هذا الإجراء سيكون هينينغ كيرجسنر، وهو فني من مختبرنا.تبدأ عن طريق خلط ملليلتر واحد من الدم المحيطي البشري رسمها حديثا مع 30 ملليلتر من ACK العازلة تحلل في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة، وملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني لغسل الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من المتوسطة الثقافة لاحتضان 60 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة خمس مرات 10 إلى الخامس المكورات العنقودية aureus enterotoxin B أو SEB محملة أو تفريغ خلايا راجي في 500 ميكرولترات من المتوسطة الثقافة في أنابيب FACS الفردية، تليها 650 ميكرولترات من الكريات البيض عموم.تدور أسفل الثقافات المشتركة، وإعادة تثبيت الكريات في 150 ميكرولترات من الثقافة الطازجة المتوسطة لاحتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم، دوامة بلطف الخلايا لمدة 10 ثانية في 100 دورة في الدقيقة في حين إضافة 1.5 ملليلتر من 1.5٪ شبهformaldehyde. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف التثبيت مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 1٪ BSA وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.Resuspend الكريات في 100 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني زائد BSA و 0.1 ٪ سابونين ، وإضافة عينات الخلية إلى اثنين من الآبار الفردية من 96 بئرا ، يو القاع لوحة. بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي لوحة وإعادة تعليق الكريات في 50 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني زائد BSA والسابونين التي تحتوي على الأجسام المضادة الفلورو-مترافق أو المركبات ذات الاهتمام لاحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، وغسل الخلايا ثلاث مرات في 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد BSA والسابونين وإعادة تعليق الكريات في 60 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.لتصوير الخلايا بواسطة عملية تدفق الخلايا، افتح برنامج التحليل، تحقق من مستوى السائل، وانقر فوق بدء التشغيل في قائمة "الأداة". بعد ذلك، انقر فوق تحميل ثم قم بتحميل العينات في المنفذ عند المطالبة. ضمن علامة التبويب الإضاءة، قم بتغيير قوة الليزر الإثارة إلى أطوال نانومتر مناسبة.ثم، ضبط البوابات للقنوات الرابعة و 11، وضبط المنطقة للقناة الأولى. لتقييم تعديلات الطاقة الغاتر والليزر، قم بالتبديل إلى القائمة عرض البوابة المعنية وضبط البوابات والقوى الليزر حتى الخلايا والأزواج الخلية مرئية. ثم، في علامة التبويب الحصول على الملفات، حدد اسم العينة وعدد الصور التي يجب الحصول عليها والبوابة المناسبة لتلوين CD3 وانقر فوق الحصول على لبدء عملية الاستحواذ.لتحليل صور الخلايا التي تم الحصول عليها، افتح برنامج التحليل المناسب. اتباع التعليمات في القائمة المنسدلة التعويض، إنتاج مصفوفة التعويض وحفظ المصفوفة كما comp date ctm. بعد ذلك، افتح نموذج ملف الصورة الخام، وتطبيق ctm تاريخ شركات في الإطار لإنشاء صورة تعويضية وملفات تحليل البيانات الافتراضية.بعد فتح ملفات الصور التعويضية، قم بتحويل الصور إلى وضع الألوان. ضبط جداول البحث للحصول على الألوان المرئية الأمثل في شريط أدوات خصائص معرض الصور. افتح "إدارة القناع" في القائمة "تحليل" ثم تعريف الخلايا T بتحديد قناع عتبة 60٪ للقناة خمسة وتعبئة القناع لإنشاء قناع الخلية T.بعد ذلك، حدد قناع الوادي للقناة الثانية بعرض ثلاثة بكسل لإنشاء قناع الوادي، وقم بدمج الخلية T وأقنعة Valley لإنشاء قناع نقاط الاشتباك العصبي في الخلية T. لحساب التعبير CD3 الإجمالي في الخلايا T، افتح "إدارة الميزات" ثم قم بإنشاء ميزة Intensity، خلية T، قناة خمسة. لحساب المبلغ الإجمالي لـ F-actin في الخلايا التائية، قم بإنشاء ميزة Intensity، الخلايا التائية، القناة السادسة.لتقييم كمية CD3 في نقاط الاشتباك العصبي المناعي، إنشاء كثافة ميزة، T الخلية المشبك، القناة الخامسة. لتحديد كمية F-actin في المشبك المناعي، إنشاء ميزة كثافة، T الخلية المشبك، القناة السادسة. وأخيراً، لتحديد إثراء F-actin و CD3، حساب نسب F-actin أو CD3 في المشبك المناعي والتعبير الكلي للبروتين المختار، على التوالي.في هذه الرسوم البيانية، يتم عرض نظرة عامة على استراتيجية ال gating الحرجة لتحديد كمية الإثراء البروتيني في المشبك المناعي بين الخلايا البديلة التي تقدم المستضدات، أو APCs، والخلايا التائية في كريات الدم البيض عموم غير مطهرة مأخوذة من عينة دم بشرية منخفضة الحجم. هنا، يتم عرض صور تمثيلية من T-خلية-APC conjugates مع مستويات منخفضة من CD3 و F-actin داخل نقاط الاشتباك العصبي المناعي في غياب SEB، في حين أن هذه conjugates T-خلية-APC إظهار الإثراء CD3 و F-actin قوية في وجود SEB. في غياب superantigen، 15٪ من الخلايا التائية أظهرت إثراء كل من CD3 و F-actin في المشبك المناعي، في حين لوحظ 29٪ من الإثراء في وجود superantigen.في الواقع، في غياب superantigen، أقل من 20٪ من مجموع F-actin في الخلايا يتراكم في المشبك المناعي، مع أكثر من 30٪ لوحظ في المشبك في وجود superantigen. وتجدر الإشارة إلى أن CD3 يتراكم في المشبك المناعي حتى في غياب superantigen، على الرغم من أن هذا التراكم أيضا زيادة كبيرة بإضافة superantigen، مما يدل على اللياقة البدنية لهذه الطريقة لتحديد كمي تراكم البروتين في المشبك المناعي خلية T-APC. وبمجرد أن يتقن، يمكن أن تكتمل هذه التقنية في ست إلى سبع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تشمل جميع الضوابط ذات الصلة، بما في ذلك العينات دون superantigen، كما يحدث إثراء البروتين أيضا إذا تم استخدام APCs دون SEB. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر فائقة الدقة للإجابة على أسئلة إضافية حول البنية الدقيقة للمناوب المناعي. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الاتصالات الخلوية لاستكشاف المشبك المناعي في البشر للأبحاث الأساسية والتجارب السريرية والعلوم الانتقالية.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل منطقة الاتصال T-cell-APC والمشابك المناعي في الخلايا التائية الإنسان السابق. لا تنس أن العمل مع المواد البشرية الأولية يمكن أن تكون خطرة وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أو العمل في إطار مستوى السلامة البيولوجية شرطين ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم المستمدة من الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...