Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Arbejdet blev finansieret af den tyske Forskningsråd (DFG) med tilskud. SFB-938-M og SA 393/3-4.

1. forberedelse af Pan-leukocytter
<ol><li>Trække 1 mL af perifert blod fra en sund donor (eller patienten) i en heparinized sprøjte. Sørg for at have godkendelse fra den ansvarlige etiske komité for blood donation.</li>
	<li>Mix 1 mL af human perifere blod med 30 mL af ACK lysisbuffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3og 0,1 mM EDTA, pH 7,0) i en 50 mL tube og Inkuber i 8 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fylde rørene med PBS og centrifugeres ved 300 x g i 6 min. aspirat supernatanten og res...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

Arbejdsprocessen præsenteres her giver mulighed for kvantificering af immun synapser mellem human T-celler (ex vivo) og pansrede mandskabsvogne. Navnlig blev erytrocyt-mængden pan-leukocytter brugt som T-celle kilder, hvilket gør T-celle rensning trin undværes. B-celle lymfom cellelinie Raji fungerede som surrogat pansrede mandskabsvogne. Dette bærer betydelige fordele, da det giver mulighed for sammenligninger mellem bloddonorer af T-celle side af den immun synapse. Derudover er autolog DCs næppe tilgængelige dir...

T-celler er store regulatorer af den adaptive immunsystem og er aktiveret gennem antigene peptider, der præsenteres i forbindelse med store histocompatibility komplekser (MHC). Fuld T-celle aktivering kræver to signaler, det kompetence signal via antigen-specifikke T-celle receptoren (TCR) / CD3 komplekset og den costimulatory signal via tilbehør receptorer. Begge signaler der genereres gennem direkte samspillet mellem T-celler og antigen-præsentere celler (PMV'er). Modne PMV'er give kompetence signal for T-celle aktivering via MHC-peptid komplekser, og de udtrykker costimulatory ligander (f.eks., CD80 eller CD86) til at sikre progression af T-celle aktivering1. En vigtig funktion af costimulation er omlejring af actin cytoskeleton2,3,4. Den kortikale F-actin er relativt statiske i hvile T-celler. T-celle stimulering gennem antigen-bærende PMV'er fører til en gennemgribende omlægning af actin cytoskelet. Aktin dynamics (dvs., hurtig actin polymerisering/depolymerization kredse) aktiverer T-celler til at oprette kræfter, der bruges til at transportere proteiner eller organeller, f.eks. Derudover er actin cytoskelettet vigtigt for at udvikle en særlig kontakt zone mellem T-celler og pansrede mandskabsvogne, kaldet immun synapse. På grund af betydningen af actin cytoskelettet til immun synapse, er det blevet vigtigt at udvikle metoder til at kvantificere ændringer i actin cytoskelettet T celler5,6,7,8 , 9.
Ved hjælp af actin cytoskeletal støtte, er overflade receptorer og signalering proteiner adskilles i Supramolekylær aktivering klynger (SMACs) inden for den immun synapse. Stabiliteten i den immun synapse er sikret ved binding af receptorer til F-actin bundter, at øger elasticiteten i actin cytoskelet. Immun synapse dannelse har vist sig at være afgørende for generation af de adaptive immunrespons. De skadelige effekter af en defekt immun synapse formation in vivo blev først realiseret i patienter, der lider fra Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sygdom i hvilken actin polymerisation og samtidig, immun synapse dannelse er forstyrret10 . VAR patienter kan lider af eksem, alvorlige tilbagevendende infektioner, autoimmune sygdomme og melanomer. Trods denne konstatering, er det i øjeblikket ikke kendt om immun synapse dannelse afviger i T-celler af raske personer og patienter med immun-defekter eller autoimmune sygdomme.
Fluorescens mikroskopi, herunder Konfokal, JOHANNAS og super-resolution mikroskopi, blev brugt til at afdække arkitekturen i immun synapse11,12,13,14. Den høje opløsning af disse systemer og mulighed for at udføre live-celle imaging muliggør indsamling af nøjagtige, spatio-temporale oplysninger om actin cytoskelettet og overflade eller intracellulære proteiner i immun synapse. Mange resultater, men er baseret på analyse af kun et par snese T-celler. Derudover skal T celler renses for disse typer af Fluorescens mikroskopi. Men for mange forskningsspørgsmål, brugen af urenset celler i stedet for den højest mulige opløsning er af allerstørste betydning. Dette er relevant, hvis T-celler fra patienter er analyseret, da mængden af donorblod er begrænset og der kan være behov for at behandle mange prøver parallelt.
Vi etablerede mikroskopiske metoder, der giver mulighed for analyse af actin cytoskelettet i immun synapse i menneskelige system15,16,17. Disse metoder er baseret på imaging flowcytometri, også kaldet In-Flow mikroskopi18. Som en hybrid mellem multispektrale flow flowcytometri og Fluorescens mikroskopi, imaging flowcytometri har sine styrker i analyse af morfologiske parametre og protein lokalisering i heterogene cellepopulationer, såsom pan-leukocytter fra den perifert blod. Vi indførte en metode, der gør det muligt at kvantificere F-actin i T-celle/APC konjugater af humane T celler fra fuldblod prøver, uden behovet for tidskrævende og dyrt rensning trin17. Teknikken præsenteret her omfatter den hele arbejdsproces fra at få blodprøve til kvantificering af F-actin i immun synapse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

Den immun synapse er inden for kommunikation mellem T-celler og antigen-præsentere celler (PMV'er). T-celler polarisere overflade receptorer og proteiner mod den immun synapse til at sikre en stabil bindende og signalere exchange. Klassisk Konfokal, JOHANNAS eller Super-resolution mikroskopi er blevet brugt til at studere den immun synapse. Da disse metoder kræver manuel billede erhvervelse og tidskrævende kvantificering, er billeddannelse af sjældne begivenheder udfordrende. Her, beskriver vi en arbejdsproces, som gør det muligt for den morfologisk analyse af titusinder af celler. Immun synapser er induceret mellem primære human T-celler i pan-leukocyt præparater og Staphylococcus aureus enterotoksin B SEB-loaded Raji celler som pansrede mandskabsvogne. Billede erhvervelse er udført med imaging flowcytometri, også kaldet In-Flow mikroskopi, som kombinerer funktionerne af et flow forskellige og et fluorescens mikroskop. Der tilbydes en komplet gating strategi til at identificere T-celle/APC par og analysere de immun synapser. Da denne arbejdsproces giver mulighed for analyse af immun synapser i urenset pan-leukocyt præparater og dermed kræver kun en lille mængde blod (dvs., 1 mL), det kan anvendes på prøver fra patienter. Vigtigere, kan flere prøver være forberedt, målt og analyseret i parallel.

Et vigtigt mål med metoden beskrevet her er kvantificering af protein berigelse (f.eks., F-actin) i den immun synapse mellem rugemor PMV'er (Raji-celler) og T-celler i urenset pan-leukocytter taget fra lav-volumen (1 mL) humant blodprøver. Skærme i figur 1 giver et overblik over den kritiske gating strategi af denne metode. Det viser, billedegalleriet til venstre og analyseområde til højre (figur 1). Billedgalleri viser "I fokus" gate. De af...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Her beskriver vi et komplet arbejdsgang for den kvalitative og kvantitative analyser af immun synapser mellem primære humane T celler og antigen-præsenterer celler. Metoden er baseret på imaging flowcytometri, som giver mulighed for erhvervelse og evaluering af flere tusinde celle billeder inden for en relativt kort periode.

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i det menneskelige immunologiske område, såsom hvordan kommunikationen mellem leukocytter sker på det molekylære og cellulære niveau. Den største fordel ved denne teknik er, at uopterede menneskelige T-celler kan analyseres ex vivo i en relativt kort periode. At demonstrere denne procedure vil være Henning Kirchgessner, en tekniker fra vores laboratorium.Begynd med at blande en milliliter frisktrukket menneskeligt perifert blod med 30 milliliter ACK lysis buffer i et 50-milliliter konisk rør. Efter otte minutter ved stuetemperatur fyldes røret med PBS for en centrifugeringsvask, og pelletsuspenderes igen i to milliliter kulturmedium til en 60-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen tilsættes fem gange 10 til den femte Staphylococcus aureus enterooxin B eller SEB-loaded eller losset Raji celler i 500 mikroliter af kulturmedium i individuelle FACS-rør, efterfulgt af 650 mikroliter pan-leukocytter.Spin ned co-kulturer, og resuspend pellets i 150 mikroliter af frisk kultur medium for en 45-minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Derefter forsigtigt vortex cellerne i 10 sekunder ved 100 rpm, mens du tilføjer 1,5 milliliter 1,5% paraformaldehyd. Efter 10 minutter ved stuetemperatur stoppes fikseringen med en milliliter PBS suppleret med 1%BSA og cellerne opsamres ved centrifugering.Opsalt pellets i 100 mikroliter af PBS plus BSA og 0,1% saponin, og tilsæt celleprøver til to individuelle brønde af en 96-brønd, U-bund plade. Efter 15 minutter ved stuetemperatur centrifugeres pladen og opslog pellets i 50 mikroliter PBS plus BSA og saponin, der indeholder fluorophorekonjugeret antistoffer eller interesseforbindelser for en 30-minutters inkubation i mørke ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes cellerne tre gange i 150 mikroliter PBS plus BSA og saponin, og pellets opsaltes i 60 mikroliter PBS.Hvis du vil afbilde cellerne efter flowcytometri, skal du åbne analysesoftwaren, kontrollere væskeniveauet og klikke på Start i menuen Instrument. Klik derefter på Indlæs, og læg prøverne i porten, når du bliver bedt om det. Under fanen Belysning skal du ændre excitationslasereffekten til de relevante nanometerlængder.Juster derefter portene til kanal fire og 11, og juster området for kanal et. Hvis du vil evaluere gating- og lasereffektjusteringerne, skal du skifte menuen Vis til den respektive port og justere porte og laserkræfter, indtil cellerne og celleparrene er synlige. Definer derefter eksempelnavnet og antallet af billeder, der skal hentes, og den relevante port til CD3-farvning under fanen Filopkøb, og klik på Hent for at starte anskaffelsen.Hvis du vil analysere de erhvervede cellebilleder, skal du åbne den relevante analysesoftware. Følg instruktionerne i rullemenuen Kompensation, fremkommer en kompensationsmatrix, og gem matrixen som comp date ctm. Åbn derefter et eksempel på en rå billedfil, og anvend comp-datoen ctm i vinduet for at generere de kompenserede billed- og standarddataanalysefiler.Når du har åbnet de kompenserede billedfiler, skal du konvertere billederne til farvetilstand. Juster opslagstabellerne for at opnå optimale synlige farver på værktøjslinjen Egenskaber for Billedgalleri. Åbn Maskestyring i menuen Analyse, og definer T-cellerne ved at markere en 60%Tærskelmaske for kanal fem og udfylde masken for at oprette T-cellemasken.Vælg derefter Valley-maske for kanal to med en bredde på tre pixel for at oprette Valley-masken, og kombiner T-celle- og Valley-maskerne for at oprette T-cellesynapsmasken. Hvis du vil beregne det samlede CD3-udtryk i T-celler, skal du åbne Funktionsstyring og oprette funktionen Intensitet, T-celle, kanal fem. Hvis du vil beregne den samlede mængde F-actin i T-cellerne, skal du oprette funktionen Intensitet, T-celler, kanal seks.Hvis du vil evaluere CD3-beløbet i immunsynapser, skal du oprette funktionen Intensitet, T-cellesynapse, kanal fem. For at bestemme mængden af F-actin i immun synapse, oprette funktionen Intensitet, T celle synapse, kanal seks. Endelig skal forholdet mellem F-actin eller CD3 i immunsynapsen og det valgte proteins samlede ekspression beregnes for at definere F-actin- og CD3-berigelsen.I disse grafer vises en oversigt over den kritiske gatingstrategi for kvantificering af proteinberigelsen i immunsynapsen mellem de surrogatantigen-præsenterende celler eller APC'er og T-cellerne i upurerede pan-leukocytter taget fra en lavvolumenblodprøve fra mennesker. Her vises repræsentative billeder af T-cell-APC konjugater med lave niveauer af CD3 og F-actin i deres immunsynapser i mangel af SEB, mens disse T-celle-APC konjugater viser en stærk CD3 og F-actin berigelse i nærværelse af SEB. I mangel af superantigen udviste 15 % af T-cellerne berigelse af både CD3 og F-actin ved immunsynapsen, mens der observeres en 29%-berigelse ved tilstedeværelse af superantigen.I mangel af superantigen ophobes mindre end 20% af den samlede F-actin i cellerne ved immunsynapsen, med over 30% observeret ved synapsen i nærvær af superantigen. Især, CD3 ophobes på immun synapse selv i mangel af superantigen, selv om denne ophobning er også betydeligt forøget ved tilsætning af superantigen, viser egnetheden af denne metode til kvantificering protein akkumulering på T-celle-APC immun synapse. Når mastered, kan denne teknik afsluttes i seks til syv timer, hvis udføres korrekt.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at inkludere alle relevante kontroller, herunder prøver uden superantigen, som protein berigelse forekommer også, hvis APC'er uden SEB anvendes. Efter denne procedure, andre metoder som super-opløsning mikroskopi kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om den fine struktur af immun synapsen. Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for cellulære kommunikation til at udforske immun synapse hos mennesker for grundforskning, kliniske forsøg, og translationel videnskab.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man analyserer T-celle-APC bindezone og immun synapse i menneskelige T-celler ex vivo. Glem ikke, at arbejde med primære menneskelige materialer kan være farligt, og at forholdsregler såsom at bære handsker eller arbejde under biosikkerhedsniveau to betingelser bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative Analyser for påvisning og karakterisering af Protein Antimikrobielle stoffer

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...