Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Het werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksraad (DFG) met subsidies Nee. SFB-938-M en SA 393/3-4.

1. voorbereiding van de Pan-leukocyten
<ol><li>1 mL van perifeer bloed trekken van een gezonde donor (of patiënt) in een heparinized spuit. Zorg ervoor dat de goedkeuring door de verantwoordelijke Ethische Commissie voor het doneren van bloed.</li>
	<li>Meng 1 mL van menselijke perifere bloed met 30 mL lysisbuffermengsel ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3en 0.1 mM EDTA, pH 7.0) in een tube van 50 mL en incubeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Vul de buizen met PBS en centrifugeer b...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

De hier gepresenteerde workflow maakt de kwantificering van immuun synapsen tussen menselijke T cellen (ex vivo) en APCs. Met name werden erytrocyt-lysed pan-leukocyten gebruikt als T-cel-bronnen, T-cel zuivering stappen overbodig maken. De B-cel lymfoom cellijn Raji diende als surrogaat APCs. Dit draagt aanzienlijke voordelen, omdat het maakt vergelijkingen tussen bloeddonoren van de kant van de T-cel van de immuun synaps. Autologe DCs kunnen bovendien nauwelijks rechtstreeks vanaf het perifere bloed. De productie van m...

T-cellen zijn grote regulatoren van het adaptieve immuunsysteem en worden geactiveerd door middel van antigene peptiden die worden gepresenteerd in het kader van grote comptabiliteit complexen (MHC). Volledige T-cel activatie vereist twee signalen, de bevoegdheid signaal via de antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) / CD3 complex en het costimulatory signaal via accessoire receptoren. Beide signalen worden gegenereerd door de directe interactie van T cellen met antigeen-presenteren cellen (APCs). Volwassen APCs geven het signaal van de bevoegdheid voor T-cel activatie door MHC-peptide complexen, en zij uiten costimulatory liganden (bijvoorbeeld, CD80 of CD86) om te verzekeren van de progressie van T-cel activatie1. Een belangrijke functie van costimulatie is de omlegging van de actine cytoskelet2,3,4. De corticale F-actine is tamelijk statisch in de rust van T-cellen. T-cel stimulatie door antigeen-bevattende APCs leidt tot een ingrijpende herinrichting van het cytoskelet actine. Actin dynamics (dwz, snel actine polymerisatie/depolymerization cirkels) kunnen de T-cellen maken van troepen die worden gebruikt voor het vervoer van proteïnen of organellen, bijvoorbeeld. Het cytoskelet actine is bovendien belangrijk voor de ontwikkeling van een speciale contact zone tussen T-cellen en APCs, genaamd de immuun synaps. Vanwege het belang van het cytoskelet van de actine aan de immuun SYNAPS, het essentieel geworden methoden kwantificeren van veranderingen in het actine cytoskelet van T cellen5,6,7,8 te ontwikkelen , 9.
Door middel van actine cytoskeletal hulp, worden oppervlakte receptoren en signalering eiwitten gescheiden in supramoleculaire activering clusters (SMACs) binnen de immuun synaps. De stabiliteit van de immuun SYNAPS wordt verzekerd door de binding van de receptoren naar F-actine bundels, waardoor de elasticiteit van het cytoskelet van actine. Immuun synapse formatie is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor de generatie van de adaptive immuunrespons. De nadelige gevolgen van een defecte immuun synapse formatie in vivo werden voor het eerst besefte bij patiënten met van Wiskott Aldrich syndroom (WAS), een ziekte in de polymerisatie van welke actine en, gelijktijdig, immuun synapse formatie worden verstoord10 . WAS patiënten kunnen lijden aan eczeem, ernstige recidiverende infecties, auto-immune ziekten en melanomen. Ondanks deze bevinding, is het op dit moment niet bekend of immuun synapse formatie verschilt in de T-cellen van gezonde individuen en patiënten met een immuun afwijkingen of auto-immune ziekten.
Fluorescentie microscopie, confocal waaronder, TIRF en super resolutie microscopie, werden gebruikt om te ontdekken de architectuur van de immuun synapse11,12,13,14. De hoge resolutie van deze systemen en de mogelijkheid om live-cel imaging kunnen de collectie van exacte, spatio-temporele informatie over het cytoskelet actine en oppervlakte of intracellulaire eiwitten in de immuun synaps. Veel resultaten worden gevonden, zijn echter gebaseerd op de analyse van slechts enkele tientallen T-cellen. Bovendien moeten de T-cellen worden gezuiverd voor deze soorten fluorescentie microscopie. Voor veel onderzoeksvragen echter het gebruik van ongezuiverde cellen in plaats van de hoogst mogelijke resolutie van het grootste belang. Dit is relevant als T-cellen van de patiënten worden geanalyseerd, aangezien het bedrag van donorbloed beperkt is en er de noodzaak wellicht voor het verwerken van vele monsters in parallel.
We gevestigde microscopische methoden waarmee de analyse van het cytoskelet van actine in de immuun SYNAPS in de menselijke systeem15,16,17. Deze methoden zijn gebaseerd op imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie18. Als een hybride tussen multispectrale stroom cytometry en fluorescentie microscopie, imaging stroom cytometry heeft zijn sterke punten in het analyseren van morfologische parameters en eiwit localisatie in heterogene cel populaties, zoals pan-leukocyten van de perifeer bloed. We introduceerden een methodologie waarmee we kunnen kwantificeren F-actine in T-cel/APC geconjugeerde van menselijke T-cellen van de volbloed monsters, zonder de behoefte aan tijdrovende en dure zuivering stappen17. De techniek die hier gepresenteerd omvat de gehele werkstroom, van het krijgen van het bloedmonster naar de kwantificering van F-actine in de immuun synaps.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

De immuun SYNAPS is het gebied van communicatie tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen (APCs). T-cellen polariseren oppervlakte receptoren en eiwitten naar de immuun SYNAPS signaal uitwisseling te verzekeren van een stabiele binding. Klassieke confocal, TIRF of Super resolutie microscopie zijn gebruikt om het bestuderen van de immuun synaps. Aangezien deze methoden handmatige Beeldacquisitie en tijdrovende kwantificering vereisen, is de beeldvorming van zeldzame gebeurtenissen uitdagend. Hier beschrijven we een workflow waarmee de morfologische analyse van tientallen duizenden cellen. Immuun synapsen veroorzaakt tussen primaire menselijke T-cellen in pan-leukocyte preparaten en Staphylococcus aureus enterotoxine B SEB-geladen Raji cellen als APCs. Beeldacquisitie wordt uitgevoerd met imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie, die eigenschappen van de cytometer van een stroom en een fluorescentie Microscoop combineert. Een complete gating strategie voor de identificatie van T-cel/APC paren en analyseren van de immuun synapsen wordt verstrekt. Als deze werkstroom kan de analyse van immune synapses in ongezuiverde pan-leukocyte preparaten en vandaar vereist slechts een kleine hoeveelheid bloed (dat wil zeggen, 1 mL), het kan worden toegepast op monsters van patiënten. Nog belangrijker is, kunnen verschillende monsters worden voorbereid, gemeten en geanalyseerd in parallel.

Een belangrijk doel van de hier beschreven methode is de kwantificering van eiwitverrijking (b.v., F-actine) in de immuun SYNAPS tussen surrogaat APCs (Raji cellen) en T cellen in ongezuiverde pan-leukocyten ontleend aan menselijke bloedmonsters van laag-volume (1 mL). De screenshot in Figuur 1 geeft een overzicht van de kritische gating strategie van deze methode. Het toont de image gallery op de linker- en het analysegebied aan de rechterkant (Figuur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het menselijke immunologische veld, zoals hoe de communicatie tussen leukocyten plaatsvindt op moleculair en cellulair niveau. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ongezuiverde menselijke T-cellen in een relatief korte periode ex vivo kunnen worden geanalyseerd. Het aantonen van deze procedure zal Henning Kirchgessner zijn, een technicus van ons laboratorium.Begin met het mengen van een milliliter vers getrokken menselijk perifeer bloed met 30 milliliter ACK lyse buffer in een 50-milliliter conische buis. Vul na acht minuten bij kamertemperatuur de buis met PBS voor een centrifugatiewassing en spoel de pellet opnieuw op in twee milliliters cultuurmedium voor een incubatie van 60 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie vijf keer 10 toe aan de vijfde Staphylococcus aureus enterotoxine B of SEB-geladen of geloste Raji-cellen in 500 microliter kweekmedium in afzonderlijke FACS-buizen, gevolgd door 650 microliter pan-leukocyten.Spin de co-culturen, en resuspend de pellets in 150 microliters van verse cultuur medium voor een 45-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Dan, voorzichtig vortex de cellen voor 10 seconden bij 100 rpm, terwijl het toevoegen van 1,5 milliliter van 1,5% paraformaldehyde. Na 10 minuten bij kamertemperatuur, stop de fixatie met een milliliter PBS aangevuld met 1%BSA en verzamel de cellen door centrifugatie.Resuspend de pellets in 100 microliters van PBS plus BSA en 0,1% saponine, en voeg de cel monsters aan twee individuele putten van een 96-well, U-bodem plaat. Na 15 minuten op kamertemperatuur, centrifugeren de plaat en resuspend de pellets in 50 microliter van PBS plus BSA en saponine met de fluorofofoof-geconjugeerde antilichamen of verbindingen van belang voor een 30-minuten incubatie in het donker bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in 150 microliters van PBS plus BSA en saponine en resuspend de pellets in 60 microliter van PBS.Als u de cellen wilt weergeven door cytometrie in de stroom stroom, opent u de analysesoftware, controleert u het vloeistofniveau en klikt u op Opstarten in het menu Instrument. Klik vervolgens op Laden en laad de monsters in de poort wanneer daarom wordt gevraagd. Verander onder het tabblad Verlichting de excitatielaserkracht in de juiste nanometerlengtes.Pas vervolgens de poorten aan voor kanaal vier en 11 en pas het gebied aan voor kanaal één. Als u de aanpassingen van de gating- en laservermogen wilt evalueren, schakelt u het menu Weergave naar de desbetreffende poort en past u de poorten en laserkrachten aan totdat de cellen en celkoppels zichtbaar zijn. Definieer vervolgens op het tabblad Bestandsacquisitie de voorbeeldnaam en het aantal afbeeldingen dat u wilt aanschaffen en de juiste poort voor CD3-kleuring en klik op Acquire om de overname te beginnen.Als u de verworven celafbeeldingen wilt analyseren, opent u de juiste analysesoftware. Volg de instructies in de vervolgkeuzelijst Compensatie, produceer een compensatiematrix en sla de matrix op als comp datum ctm. Open vervolgens een voorbeeld van een raw-afbeeldingsbestand en pas de comp-datum-ctm toe in het venster om de gecompenseerde afbeeldings- en standaardgegevensanalysebestanden te genereren.Nadat u de gecompenseerde afbeeldingsbestanden hebt geopend, converteert u de afbeeldingen naar de kleurmodus. Pas de opzoektabellen aan om optimale zichtbare kleuren te verkrijgen op de werkbalk Eigenschappen van afbeeldingsgalerie. Open Maskerbeheer in het menu Analyse en definieer de T-cellen door een masker van 60%Drempelwaarde voor kanaal vijf te selecteren en het masker te vullen om het T-celmasker te maken.Selecteer vervolgens Valley-masker voor kanaal twee met een breedte van drie pixels om het Valley-masker te maken en combineer de T-cel en valleimaskers om het T-celsynapsmasker te maken. Als u de totale CD3-expressie in T-cellen wilt berekenen, opent u Functiebeheer en maakt u de functie Intensiteit, T-cel en kanaal vijf. Als u de totale hoeveelheid F-actin in de T-cellen wilt berekenen, maakt u de functie Intensiteit, T-cellen, kanaal zes.Om de CD3-hoeveelheid in immuunsynapsen te evalueren, maakt u de functie Intensiteit, T-celsynaps, kanaal vijf. Om de hoeveelheid F-actine in de immuunsynaps te bepalen, maakt u de functie Intensiteit, T-celsynaps, kanaal zes. Ten slotte, om de F-actine en CD3 verrijking te definiëren, berekent u de verhoudingen van F-actine of CD3 in respectievelijk de immuunsynaps en de totale expressie van het geselecteerde eiwit.In deze grafieken wordt een overzicht getoond van de kritische gatingstrategie voor het kwantificeren van de eiwitverrijking in de immuunsynaps tussen de draagzuurhoudende cellen, of APC's, en de T-cellen in ongezuiverde pan-leukocyten uit een klein volume menselijk bloedmonster. Hier worden representatieve afbeeldingen getoond van T-cell-APC conjugaten met lage cd3- en F-actine-niveaus in hun immuunsynapsen bij afwezigheid van SEB, terwijl deze T-cel-APC-vervoeging een sterke CD3- en F-actinverrijking in aanwezigheid van SEB aantoont. Bij afwezigheid van superantigen vertoonde 15% van de T-cellen verrijking van zowel CD3 als F-actine bij de immuunsynaps, terwijl een verrijking van 29% wordt waargenomen in aanwezigheid van superantigenen.Bij afwezigheid van superantigen hoopt minder dan 20% van de totale F-actine in de cellen zich op bij de immuunsynaps, met meer dan 30% waargenomen bij de synaps in aanwezigheid van superantigenen. Met name, CD3 accumuleert bij de immuunsynaps zelfs bij afwezigheid van superantigen, hoewel deze accumulatie ook aanzienlijk wordt verhoogd door de toevoeging van superantigen, waaruit blijkt dat de geschiktheid van deze methode voor het kwantificeren van eiwitaccumulatie bij de T-cel-APC immuunsynaps. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden voltooid in zes tot zeven uur indien goed uitgevoerd.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om alle relevante controles op te nemen, inclusief monsters zonder superantigen, omdat eiwitverrijking ook optreedt als APC's zonder SEB worden gebruikt. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals microscopie met superresolutie worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de fijne structuur van de immuunsynaps te beantwoorden. Na de ontwikkeling, deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van cellulaire communicatie om het immuunsysteem synaps bij de mens te verkennen voor fundamenteel onderzoek, klinische proeven, en translationele wetenschap.Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe de T-cel-APC connective zone en het immuunsysteem synaps in menselijke T-cellen ex vivo te analyseren. Vergeet niet dat het werken met primaire menselijke materialen gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen of werken onder bioveiligheidsniveau twee voorwaarden altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kwantitatieve beoordeling van immuuncellen in de gekwetste ruggenmergweefsel door flowcytometrie: een roman te gebruiken voor een cel zuiveringsmethode

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...