Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

작품 번호 보조금 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 투자 되었다 SFB-938-M 고 SA 393/3-4.

1입니다. 팬 백혈구의 준비
<ol><li>Heparinized 주사기에 건강 한 기증자 (또는 환자)에서 말 초 혈액의 1 mL를 그립니다. 헌 혈에 대 한 책임 윤리 위원회에 의해 승인 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>믹스 1 mL의 인간 주변 혈액을 30 mL 50 mL 튜브에 ACK 세포의 용 해 버퍼 (150mm NH4Cl, 1 mM KHCO3, 그리고 0.1 m m EDTA, pH 7.0)와 고 실 온에서 8 분 동안 품 어.</li>
	<li>PBS와 6 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 30...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

여기에 제시 된 워크플로 (ex vivo) 인간 T 세포와 APCs 사이 면역 시 냅 스의 정량화를 수 있습니다. 특히, 팬-백혈구 적혈구 lysed 불가결 T 세포 정화 단계를 만드는 T-셀 원본으로 사용 되었다. B-세포 림프 종 세포 라인 들의 삶 문의 대리 APCs 역임 했습니다. 면역 시 냅 스의 T-세포의 혈액 기증자 사이 비교 수 있기 때문이 맺는 중요 한 이점이 다. 또한, 헌 Dc 거의 주변 인간의 혈액에서 직접 사용할 수 ...

T 세포는 적응 면역 시스템의 주요 규제 하 고 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC)의 맥락에서 제시 하는 항 원 펩 티 드를 통해 활성화 됩니다. 전체 T 세포 활성화 필요 2 개의 신호, 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCR)를 통해 능력 신호 / CD3 복합물 및 액세서리 수용 체를 통해 costimulatory 신호. 두 신호는 항 원 제시와 T 세포의 직접적인 상호 작용을 통해 생성 된 세포 (Apc). 성숙한 APCs MHC 펩 티 드 복합물을 통해 T 세포 활성화에 대 한 적성 신호를 제공 하 고 그들은 costimulatory ligands 표현 (예:, CD80 또는 CD86) T 세포 활성화1의 진행을 보장 하기 위해서. Costimulation의 1 개의 중요 한 기능 말라 골격2,,34의 재배치입니다. 대뇌 피 질의 F 걸 T 세포 휴식에서 상대적으로 정적입니다. 항 원-베어링 APCs 통해 T 세포 자극 말라 골격의 심오한 재배치에 지도 한다. 말라 역학 (즉,, 빠른 걸 합/depolymerization 원) T 세포를 만드는 단백질 이나 세포, 예를 들어 전송 하는 데 사용 되는 힘을 사용 합니다. 또한, 말라 골격은 T 세포 및 면역 시 냅 스 라고 하는 APCs 사이 특별 한 연락처 영역을 개발 하기 위한 중요 합니다. 면역 시 냅 스를 말라 골격의 중요성 때문에 그것은 T 세포5,6,,78 의 말라 골격에 변화를 측정 하는 방법을 개발 하기 위해 필수적인 되고있다 , 9.
말라 cytoskeletal 원조에 의하여 표면 수용 체와 신호 전달 단백질 supramolecular 활성화 클러스터 (SMACs) 면역 시 냅 스 내에서 차별 됩니다. 면역 시 냅 스의 안정성은 말라 골격의 신축성을 증가 하는 F-말라 번들에 수용 체의 바인딩을 의해 보장 됩니다. 면역 시 냅 스 형성은 적응형 면역 반응의 생성에 대 한 중요 한 것을 보였다. Vivo에서 결함이 있는 면역 시 냅 스 대형의 해로운 효과 했다 깨 달 았에서 Wiskott 올드 리치 증후군 (WAS), 어떤 걸 중 합에는 질병을 고통 받아 환자에서 면역 시 냅 스 형성을 방해 하는 수반, 그리고10 . 환자는 습 진, 심한 재발 성 감염, 자가 면역 질환, 그리고 정면을에서 고통을 수 있습니다 했다. 이 발견에도 불구 하 고 그것은 현재 알 수 없습니다 면역 결함 또는 자가 면역 질환으로 고통 받는 환자와 건강 한 개인의 T 세포에서 면역 시 냅 스 형성 다릅니다 여부.
형광 현미경 검사 법, confocal 포함, TIRF, 및 최고 해결책 현미경 검사 법, 면역 시 냅 스11,12,,1314의 아키텍처를 밝히기 위해 사용 되었다. 이러한 시스템의 높은 해상도 라이브 셀 이미징 수행 가능성 말라 골격과 면역 시 냅 스에 표면 또는 세포내 단백질에 대 한 정확한, spatio 시간적 정보 수집 수 있습니다. 그러나 많은 결과, 몇 수십 T 세포의 분석에 근거한 다. 또한, 이러한 유형의 형광 현미경 검사 법에 대 한 T 세포를 정화 해야 합니다. 그러나, 많은 연구 질문에 대 한 unpurified 셀 보다는 가능한 가장 높은 해상도의 사용은 매우 중요. 이것은 환자에서 T 세포는 분석 때문에 헌 혈 된 혈액의 양을 제한 하 고 동시에 많은 샘플을 처리할 필요가 있을 수 있습니다 하는 경우 이다.
우리 인간의 시스템15,,1617면역 시 냅 스에 걸 골격의 분석을 허용 하는 현미경 방법을 설립 했다. 이러한 메서드는 흐름에 현미경18라고도 cytometry 이미징 기반으로 합니다. Multispectral 흐름 cytometry 및 형광 현미경 사이의 하이브리드, cytometry 이미징 장점이 그것의 형태학 매개 변수 및 다른 유형의 세포 인구에서 팬 백혈구 등에서 단백질 지역화 분석에 주변 혈액입니다. 우리는 우리가 시간과 비용이 많이 드는 정화 단계17의 필요 없이 전체 혈액 샘플에서 인간 T 세포의 T-셀/APC 어원이 같은 말에 F-말라를 계량 수 있습니다 하는 방법 소개. 여기에 제시 된 기술은 면역 시 냅 스에 F 걸의 정량화를 혈액 샘플에서 전체 워크플로 구성 되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

면역 시 냅 스는 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) 간의 통신의 영역입니다. T 세포 표면 수용 체와 안정적인 바인딩을 확신 하 고 교류 신호를 면역 냅으로 단백질 분극. 클래식 confocal, TIRF, 또는 슈퍼 해상도 현미경 면역 시 냅 스 연구에 사용 되었습니다. 때문에 이러한 방법을 사용 하려면 수동 이미지 수집 및 시간이 걸리는 정량화, 드문 이벤트의 영상 도전 이다. 여기, 우리 세포의 수천 수만의 형태소 분석을 가능 하 게 워크플로 설명 합니다. 면역 시 냅 스는 Apc로 팬 백혈구 준비에 기본 인간 T 세포와 황색 포도상구균 enterotoxin B 셉 로드 들의 삶 문의 세포 사이 유도. 이미지 수집 이미징 cytometry 라고도 흐름에 현미경 검사 법, 교류 cytometer 및 형광 현미경의 기능을 결합 하 여 수행 됩니다. T 세포/APC 커플 식별 하 고 분석 하는 면역 시 냅 스에 대 한 완전 한 제어 전략은 제공 됩니다. 면역 분석 unpurified 팬-백혈구 준비에 synapses 하며 따라서 작은 양의 혈액이이 허용 (즉,, 1 mL), 환자에서 샘플에 적용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여러 샘플 준비, 측정, 고 병렬로 분석.

여기서 설명 하는 방법의 주요 목표는 단백질 농축의 정량화 (예:, F-말라) 사이 면역 시 냅 스에서 대리 Apc (셀 들의 삶 문의)와 낮은 볼륨 (1 mL) 인간의 혈액 샘플에서 가져온 unpurified 팬 백혈구에 T 세포. 그림 1 의 스크린샷은이 방법의 중요 한 제어 전략에 대 한 개요를 제공합니다. 그것은 왼쪽 및 오른쪽 (그림 1)의 분석 영역에 이미지 갤러...

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Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

이 방법은 백혈구 사이의 통신이 분자 및 세포 수준에서 발생하는 방법과 같은 인간 면역 학적 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무정제 인간 T 세포가 비교적 짧은 기간 동안 ex vivo를 분석할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 헤닝 Kirchgessner 될 것입니다.50 밀리리터 원뿔관에 30 밀리리터의 ACK 용해 완충제와 갓 뽑은 인간 말초 혈액 1밀리리터를 혼합하여 시작합니다. 실온에서 8분 후, 원심 분리 세척을 위해 PBS로 튜브를 채우고 37°C에서 60분 동안 배양 배지 2밀리리터로 펠릿을 재보냅니다. 인큐베이션이 끝나면 500마이크로리터의 개별 FACS 튜브에 배양 배지의 500마이크로리터에 제5차 황색포도상구균 B 또는 SEB 장전 또는 언로드 라지 세포에 5회 10번 추가한 다음, 650마이크로리터의 팬백세포를 첨가한다.공동 배양을 회전시키고, 37섭씨에서 45분 간 잠복할 수 있도록 신선한 배양 배지의 150마이크로리터에서 펠릿을 재보선한다. 그런 다음 100 rpm에서 10 초 동안 세포를 부드럽게 소용돌이치면서 1.5 % 파라 포름알데히드의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 실온에서 10 분 후, 1 %BSA로 보충 된 PBS의 1 밀리리터로 고정을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.PBS 플러스 BSA 및 0.1% 사포닌의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 96-well, U-바닥 플레이트의 두 개의 개별 우물에 세포 샘플을 추가합니다. 실온에서 15분 후, 플레이트를 원심분리하고 PBS 의 50 마이크로리터에 펠릿을 재분배하고 실온에서 어둠 속에서 30분 동안 용해된 형광구 공주 항체 또는 화합물을 포함하는 BSA 및 사포닌의 마이크로리터로 펠릿을 재연한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 BSA 및 사포닌의 150 마이크로리터에서 세포를 세 번 세척하고 PBS의 60 마이크로리터에서 펠릿을 재보종합니다.흐름 세포측정에 의해 셀을 이미지하려면 분석 소프트웨어를 열고 액체 수준을 확인하고 악기 메뉴에서 시작을 클릭합니다. 다음으로 로드를 클릭하고 메시지가 표시되면 샘플을 포트에 로드합니다. 조명 탭에서, 적절한 나노 미터 길이에 여기 레이저 전력을 변경합니다.그런 다음 채널 4및 11의 게이트를 조정하고 채널 1의 영역을 조정합니다. 게이팅 및 레이저 전원 조정을 평가하려면 View 메뉴를 각 게이트로 전환하고 셀과 셀 커플이 표시될 때까지 게이트 및 레이저 전원을 조정합니다. 그런 다음 파일 수집 탭에서 수집할 샘플 이름과 이미지 수와 CD3 염색에 적합한 게이트를 정의하고 인수를 클릭하여 인수를 시작합니다.획득한 셀 이미지를 분석하려면 적절한 분석 소프트웨어를 엽니다. 보상 드롭다운의 지침에 따라 보정 행렬을 생성하고 매트릭스를 컴포지션 날짜 ctm로 저장합니다. 다음으로 샘플 원시 이미지 파일을 열고 창에 컴프 날짜 ctm을 적용하여 보정된 이미지 및 기본 데이터 분석 파일을 생성합니다.보정된 이미지 파일을 연 후 이미지를 색상 모드로 변환합니다. 조회 테이블을 조정하여 이미지 갤러리 속성 도구 모음에서 최적의 가시 색상을 가져옵니다. 분석 메뉴에서 마스크 관리자를 열고 채널 5용 60%임계값 마스크를 선택하고 마스크를 채우고 T 셀 마스크를 작성하여 T 셀 셀을 정의합니다.다음으로, 밸리 마스크를 만들기 위해 3 픽셀의 폭으로 채널 2에 대한 밸리 마스크를 선택하고 T 셀과 밸리 마스크를 결합하여 T 셀 시냅스 마스크를 만듭니다. T 셀에서 총 CD3 식을 계산하려면 피처 관리자를 열고 피쳐 강도, T 셀, 채널 5를 만듭니다. T 셀에서 F-actin의 총 양을 계산하려면 피쳐 강도, T 셀, 채널 6을 만듭니다.면역 시냅스에서 CD3 양을 평가하려면 피쳐 강도, T 셀 시냅스, 채널 5를 만듭니다. 면역 시냅스에서 F-actin의 양을 결정하려면, 기능 강도, T 세포 시냅스, 채널 6을 만듭니다. 마지막으로, F-actin 및 CD3 농축을 정의하기 위해, 면역 시냅스에서 F-액틴 또는 CD3의 비율과 선택된 단백질의 총 발현을 각각 계산한다.이들 그래프에서, 대리 항원 제시 세포, 또는 AFC 사이의 면역 시냅스에서 단백질 농축을 정량화하기 위한 중요한 게이팅 전략의 개요, 그리고 낮은 부피 인간 혈액 샘플에서 채취한 무정제 범류세포에서 T 세포가 나타난다. 여기서, T세포-APC의 대표적인 이미지는 SEB의 부재 시내에 있는 CD3 및 F-actin의 낮은 수준을 가진 공자, 이러한 T세포-APC 컨쥬게이트는 SEB의 존재에 강한 CD3 및 F-actin 농축을 보여줍니다. 초항제의 부재에서, T 세포의 15%는 면역 시냅스에서 CD3와 F-actin 의 농축을 나타내고, 반면 29%의 농축은 초안티겐의 존재에서 관찰된다.실제로, 초항제가 없는 경우, 세포내 총 F-actin의 20% 미만이 면역 시냅스에서 축적되고, 초대형항성원이 있는 시냅스에서 30% 이상이 관찰된다. 특히, CD3는 초항제가 없는 경우에도 면역 시냅스에서 축적되지만, 이러한 축적은 또한 수퍼안티겐의 첨가에 의해 현저하게 증가하지만, T세포-APC 면역 시냅스에서 단백질 축적을 정량화하는 이 방법의 적합성을 입증한다. 일단 마스터되면 제대로 수행하면 6~7시간 안에 이 기술을 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 단백질 농축은 또한 SEB없이 APC를 사용하는 경우에 생깁니다, 초항제없이 견본을 포함하여 모든 관련 대조를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 초해상도 현미경 검사법과 같은 다른 방법은 면역 시냅스의 미세 한 구조에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 기본적인 연구, 임상 시험 및 번역 과학을 위한 인간에 있는 면역 시냅스를 탐구하기 위하여 세포 통신의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.이 비디오를 본 후, 당신은 인간 T 세포 ex vivo에서 T 세포-APC 결합 영역 및 면역 시 냅 스를 분석 하는 방법의 좋은 이해 해야. 1차 인간 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 장갑을 착용하거나 생물 안전 수준 하에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...