Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Arbetet finansierades av de Tyskt forskningrådet (DFG) med bidrag nr. SFB-938-M och SA 393/3-4.

1. beredning av Pan-leukocyter
<ol><li>Dra 1 mL av perifert blod från en frisk givare (eller patienten) i hepariniserad spruta. Se till att ha godkännande av ansvariga etikkommittén för blodgivningen.</li>
	<li>Blanda 1 mL humant perifert blod med 30 mL ACK lyseringsbuffert (150 mM NH4Cl och 1 mM KHCO30,1 mM EDTA, pH 7,0) i en 50 mL tub och inkubera i 8 min i rumstemperatur.</li>
	<li>Fyll rören med PBS och centrifugera vid 300 x g för 6 min. Aspirera supernatanten och återsuspende...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

Arbetsflödet presenteras här möjliggör kvantifiering av immun synapser mellan mänskliga T-celler (ex vivo) och trupptransportfordon. Bland annat användes erytrocyt-lyserat pan-leukocyter som T-cell källor, att göra T-cell reningssteg dispensable. B-cells lymfom cellinje Raji tjänstgjorde som surrogat trupptransportfordon. Detta bär betydande fördelar, eftersom det tillåter jämförelser mellan blodgivare av T-cell sida av immun synapsen. Vidare, autolog DCs finns knappast direkt från perifert blod. Produktio...

T-celler är större regulatorer av det adaptiva immunsystemet och aktiveras genom antigena peptider som presenteras i samband med större histocompatibility komplex (MHC). Fullständig aktivering av T-celler kräver två signaler, kompetens signalen via den antigen-specifika T-cells receptorn (TCR) / CD3 komplex och costimulatory signalen via tillbehör receptorer. Båda signaler genereras genom direkt samverkan mellan T-celler med antigen-presenterande celler (APC). Mogen trupptransportfordon tillhandahåller kompetens signal för T-cells aktivering via MHC-peptid komplex, och de costimulatory ligander (t.ex., CD80 eller CD86) att säkerställa utvecklingen av T-cells aktivering1. En viktig funktion för costimulation är omordningen av aktin cytoskelettet2,3,4. Den kortikala F-aktin är relativt statisk i vila T-celler. T-cell stimulering genom antigen-bärande trupptransportfordon leder till en djupgående ombildning av aktin cytoskelettet. Aktin dynamics (dvs., snabb aktin polymerisation/depolymerization cirklar) aktivera T-cellerna att skapa krafter som används för transport av proteiner eller organeller, t.ex. Aktin cytoskelettet är dessutom viktig för att utveckla en särskild kontakt zon mellan T-celler och trupptransportfordon, kallas immun synapsen. På grund av vikten av aktin cytoskelettet till immun synapsen, har det blivit nödvändigt att utveckla metoder för att kvantifiera förändringar i aktin cytoskelettet av T celler5,6,7,8 , 9.
Med hjälp av aktin cytoskeletal stöd, är yta receptorer och signalering proteiner åtskilda i supramolekylär aktiveringen kluster (SMACs) inom immun synapsen. Stabiliteten i immun synapsen säkerställs genom bindning av receptorer till F-aktin buntar som ökar elasticiteten i aktin cytoskelettet. Immun synaps bildandet har visat sig vara avgörande för generering av adaptiva immunsvaret. De skadliga effekterna av ett defekt immunförsvar synaps bildas i vivo realiserades först hos patienter som lider från Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sjukdom som aktin polymerisation och, samtidigt, immun synaps bildas störs10 . VAR patienter kan drabbas av eksem, återkommande infektioner, autoimmuna sjukdomar och melanom. Trots detta fynd, är det för närvarande inte känt huruvida immuna synaps bildas skiljer sig i de T-cellerna av friska individer och patienter lider av immundefekter eller autoimmuna sjukdomar.
Fluorescensmikroskopi, inklusive confocal, Frida och super-resolution mikroskopi, användes för att avslöja arkitekturen av immun synaps11,12,13,14. Den höga upplösningen av dessa system och möjlighet att utföra live-cell imaging möjliggör insamling av exakt plats och tid information om aktin cytoskelettet och ytan eller intracellulära proteiner i immun synapsen. Många resultat, dock är baserade på analys av bara några tiotals T-celler. Dessutom måste T-celler renas för dessa typer av fluorescensmikroskopi. Men för många forskningsfrågor är användning av orenat celler i stället för högsta möjliga upplösning av yttersta vikt. Detta är relevant om T-celler från patienter analyseras, sedan av donerat blod är begränsad och det kan vara behovet av att bearbeta många prover parallellt.
Vi etablerade mikroskopiska metoder som möjliggör analys av aktin cytoskelettet i immun synapsen i mänskliga systemet15,16,17. Dessa metoder bygger på imaging flödescytometri, även kallad i-Flow mikroskopi18. Som en hybrid mellan Multispektrala flöde flödescytometri och fluorescence mikroskopi, imaging flödescytometri har sina styrkor i analysera morfologiska parametrar och protein lokalisering i heterogena cellpopulationer, såsom pan-leukocyter från den perifert blod. Vi införde en metod som gör det möjligt för oss att kvantifiera F-aktin i T-cell/APC konjugat av humant T-celler från helblod prover, utan behov av tidskrävande och kostsamma rening steg17. Tekniken presenteras här omfattar hela arbetsflödet, från att få blodprovet att kvantifiering av F-aktin i immun synapsen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

Immun synapsen är området för kommunikation mellan T-celler och antigen-presenterande celler (APC). T-celler polarisera yta receptorer och proteiner mot immun synapsen till försäkrar en stabil bindning och signalera exchange. Klassiskt confocal, Frida eller super-resolution mikroskopi har använts för att studera immun synapsen. Eftersom dessa metoder kräver manuell bild förvärv och tidskrävande kvantifiering, är bildtagning av sällsynta händelser utmanande. Här beskriver vi ett arbetsflöde som möjliggör morfologiska analyser av tiotusentals celler. Immun synapser induceras mellan primära humant T-celler i pan-leukocyt preparat och Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-loaded Raji celler som trupptransportfordon. Bild Förvärvandet utförs med imaging flödescytometri, även kallad i-Flow mikroskopi, som kombinerar funktionerna i en flödescytometer och fluorescens Mikroskop. En komplett Usenets strategi för att identifiera T cell/APC par och analysera immun synapserna tillhandahålls. Som det här arbetsflödet tillåter analys av immun synapser i orenat pan-leukocyt preparat och därmed kräver endast en liten mängd blod (dvs., 1 mL), det kan tillämpas på prover från patienter. Allt kan flera prover vara beredd, mäts och analyseras parallellt.

Ett viktigt mål för den metod som beskrivs här är kvantifiering av protein anrikning (t.ex., F-aktin) i immun synapsen mellan surrogat trupptransportfordon (Raji celler) och T-celler i orenat pan-leukocyter tas från låg volym (1 mL) humant blodprover. Skärmdumpen i figur 1 ger en översikt över den kritiska Usenets strategin av denna metod. Det visar Bildgalleri till vänster och analysområde till höger (figur 1). Bildgalleriet visar st...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Här beskriver vi ett komplett arbetsflöde för kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapser mellan primära humant T-celler och antigen-presenterande celler. Metoden är baserad på imaging flödescytometri, som tillåter förvärv och utvärdering av flera tusen cell bilder inom en relativt kort tidsperiod.

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Denna metod kan bidra till att besvara viktiga frågor inom det mänskliga immunologiska området, till exempel hur kommunikationen mellan leukocyter sker på molekylär och cellulär nivå. Den största fördelen med denna teknik är att unpurified mänskliga T-celler kan analyseras ex vivo i en relativt kort tidsperiod. Demonstrera denna procedur kommer att Henning Kirchgessner, en tekniker från vårt laboratorium.Börja med att blanda en milliliter nyritad humant perifert blod med 30 milliliter ACK lysbuffert i ett koniskt rör på 50 milliliter. Efter åtta minuter i rumstemperatur fyller du röret med PBS för en centrifugeringstvätt och återanvänder pelleten i två milliliter odlingsmedium för en 60-minuters inkubation vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, tillsätt fem gånger 10 till den femte Staphylococcus aureus enterotoxin B eller SEB-lastade eller lossade Raji celler i 500 mikroliter av odlingsmedium i enskilda FACS rör, följt av 650 mikroliter av pan-leukocyter.Snurra ner co-kulturer, och återanvända pellets i 150 mikroliter av färskt odlingsmedium för en 45-minuters inkubation vid 37 grader Celsius. Sedan, försiktigt virvel cellerna i 10 sekunder vid 100 rpm samtidigt lägga till 1,5 milliliter av 1,5%paraformaldehyd. Efter 10 minuter i rumstemperatur, stoppa fixeringen med en milliliter PBS kompletterat med 1%BSA och samla in cellerna genom centrifugeringen.Resuspend pellets i 100 mikroliter av PBS plus BSA och 0,1%saponin, och tillsätt cellprover till två enskilda brunnar av en 96-brunn, U-botten platta. Efter 15 minuter i rumstemperatur centrifugerar plattan och återanvänder pelletsen i 50 mikroliter pbs plus BSA och saponin som innehåller de fluoroforekonjugerade antikropparna eller föreningarna av intresse för en 30-minuters inkubation i mörker vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, tvätta cellerna tre gånger i 150 mikroliter pbs plus BSA och saponin och återanvända pellets i 60 mikroliter pbs.Om du vill avbilda cellerna efter flödescytometri öppnar du analysprogramvaran, kontrollerar vätskenivån och klickar på Start i Instrument-menyn. Klicka därefter på Läs in, och ladda proverna i porten när du uppmanas att göra det. Under fliken Belysning ändrar du excitationslasereffekten till lämpliga nanometerlängder.Justera sedan portarna för kanalerna fyra och 11, och justera området för kanal ett. För att utvärdera gating och laser power justeringar, växla Visa-menyn till respektive grind och justera grindar och laser befogenheter tills cellerna och cellen par är synliga. Sedan, i fliken Filförvärv, definiera exempelnamnet och antalet bilder att skaffa och lämplig grind för CD3-färgning och klicka på Förvärva för att påbörja förvärvet.För att analysera de förvärvade cellbilderna öppnar du lämplig analysprogramvara. Efter instruktionerna i den Kompensation dropdown, producera en kompensation matris och spara matrisen som comp datum CTM. Därefter öppnar du en exempelgjÃ:n raw image-fil, och anvÃ-nder kompdatum ctm i fönstret för att generera de kompenserade bild- och standarddataanalysfilerna.Efter att de kompenserade bildfilerna öppnats, konverterar du bilderna till färgläget. Justera uppslagstabellerna så att optimala synliga färger erhålls i verktygsfältet Egenskaper för bildgalleri. Öppna Maskhanteraren på Analys-menyn och definiera T-cellerna genom att välja en 60%Tröskelmask för kanal fem och fyll masken för att skapa T-cellmasken.Därefter väljer du Valley-mask för kanal två med en bredd på tre pixlar för att skapa Valley-masken och kombinera T-cellen och Valley-maskerna för att skapa T-cellens synapsmask. Om du vill beräkna det totala CD3-uttrycket i T-celler öppnar du Funktionens hanteraren och skapar funktionen Intensitet, T-cell, kanal fem. Om du vill beräkna den totala mängden F-aktin i T-cellerna skapar du funktionen Intensitet, T-celler, kanal sex.För att utvärdera CD3-mängden i immunsynapser, skapa funktionen Intensitet, T-cell synaps, kanal fem. För att bestämma mängden F-aktin i immunsynapsen, skapa funktionen Intensitet, T-cell synaps, kanal sex. Slutligen, för att definiera F-aktin och CD3 anrikning, beräkna förhållandet mellan F-aktin eller CD3 i immun synaps och det totala uttrycket för det valda proteinet, respektive.I dessa grafer visas en översikt över den kritiska gating-strategin för kvantifiering av proteinanrikningen i immunsynapsen mellan surrogatantgenpresenterande celler, eller APC, och T-cellerna i oanvända pan-leukocyter som tagits från ett humant blodprov med låg volym. Här visas representativa bilder av T-cell-APC konjugater med låga nivåer av CD3 och F-aktin inom sina immunsynapser i frånvaro av SEB, medan dessa T-cell-APC konjugerar uppvisar en stark CD3 och F-aktinberikning i närvaro av SEB. I avsaknad av superantigen uppvisade 15%av T-cellerna anrikning av både CD3 och F-aktin vid immunsynapsen, medan en 29%anrikning observeras i närvaro av superantigen.I avsaknad av superantigen ackumuleras i själva verket mindre än 20% av det totala F-aktin i cellerna vid immunsynapsen, med över 30%observerat vid synapsen i närvaro av superantigen. Noterbart, CD3 ackumuleras vid immun synapsen även i avsaknad av superantigen, även om denna ackumulering också ökas avsevärt genom tillsats av superantigen, visar lämpligheten av denna metod för att kvantifiera protein ackumulering vid T-cell-APC immun synaps. När behärskar, kan denna teknik slutföras i sex till sju timmar om de utförs på rätt sätt.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att inkludera alla relevanta kontroller, inklusive prover utan superantigen, som proteinberikning uppstår också om APC:er utan SEB används. Efter detta förfarande kan andra metoder som super-upplösning mikroskopi utföras för att svara på ytterligare frågor om den fina strukturen av immun synaps. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom cellulär kommunikation för att utforska immunsynapsen hos människor för grundforskning, kliniska prövningar och translationell vetenskap.Efter att ha sett den här videon bör du ha en god förståelse för hur man analyserar T-cell-APC-bindzonen och immunsynapsen i mänskliga T-celler ex vivo. Glöm inte att det kan vara farligt att arbeta med primära humana material och att försiktighetsåtgärder som att bära handskar eller arbeta under villkor på biosäkerhetsnivå två alltid bör vidtas när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kvantitativ bedömning av immunceller i den skadade ryggmärg med flödescytometri: en ny användning för en cell reningsmetod

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mänskliga In Vitro Suppression som screeningmetod för erkännande av en tidig staten Immune obalans

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel och snabb protokoll till icke enzymatiskt dissociera Färska mänskliga vävnader för analys av lymfocyter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos<em&gt; In Vivo</em&gt; Med hjälp av en flödescytometri-baserad analys

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analys av Microglia och monocyt-härledda makrofager från det centrala nervsystemet genom flödescytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...