Name: qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

İşi Alman Araştırma Konseyi (DFG) tarafından hibe ile No finanse edildi SFB-938-M ve SA 393/3-4.

1. Pan-lökosit hazırlanması
<ol><li>1 mL periferik kan heparinized bir şırıngada bir sağlıklı donör (veya hasta) çizin. Kan bağışı için sorumlu Etik Komitesi tarafından onay emin olun.</li>
	<li>İnsan periferik Mix 1 mL 30 mL ACK lizis arabellek (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3ve 0,1 mM EDTA, pH 7,0) 50 mL tüp ile kan ve oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS ve 6 dk. aspiratı süpernatant 300 x g , santrifüj tüpleri doldurun ve Pelet ACK lizis arabellek...

<ol>
	<li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+Costimulation:+From+Mechanism+to+Therapy.">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li><li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration.">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li><li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin:+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration.">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li><li>Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+and+Traction:+Cytoskeletal+Control+of+Receptor+Triggering+at+the+Immunological+Synapse.">Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse.</a> Front Immunol. 7, 68 (2016).</li><li>Piragyte, I., Jun, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+engine+in+immunological+synapse.">Actin engine in immunological synapse.</a> Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).</li><li>Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+of+the+immunological+synapse.">Super-resolution microscopy of the immunological synapse.</a> Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse.">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li><li>Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+immunological+synapse+between+dendritic+cells+and+T+cells.">Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells.</a> J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).</li><li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiskott-Aldrich+Syndrome:+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation.">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques.">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin.">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InFlow+microscopy+of+human+leukocytes:+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse.">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li><li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li><li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy.">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li><li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN/T-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy.">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li><li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen.">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li></ol>

Burada sunulan iş akışı insan T hücreleri (ex vivo) ve ZPT arasında bağışıklık sinapslarda miktar sağlar. Özellikle, eritrosit lysed pan-lökosit T hücreli arıtma adımları gereksiz yapma T-hücre kaynağı olarak kullanıldı. B hücreli lenfoma hücre kültürünü Raji ZPT vekil olarak görev yaptı. Kan bağış bağışıklık synapse T hücreli tarafı arasında karşılaştırma yapmayı sağlar beri bu önemli avantajları, ayılar. Ayrıca, otolog DCs doğrudan periferik kan grubundan pek mevcutt...

T hücreleri edinilmiş bağışıklık sisteminin ana düzenleyiciler edilir ve MHC kompleksi (MHC) kapsamında sunulan antijenik peptidler aracılığıyla etkinleştirilir. Tam T Hücre aktivasyonu gerektirir iki sinyal, antijen spesifik T-hücre reseptör (TCR) üzerinden yetkinlik sinyal / CD3 kompleksi ve costimulatory sinyal aksesuar reseptörleri üzerinden. Her iki sinyali antijen sunma ile T hücrelerinin etkileşimi doğrudan aracılığıyla oluşturulan hücreler (ZPT). Olgun ZPT yetkinlik sinyal MHC-peptid kompleksi ile T Hücre aktivasyonu için sağlamak ve costimulatory ligandlar express (örneğin, CD80 veya CD86) T-hücre harekete geçirmek1ilerlemesini sağlamak için. Bir önemli costimulation düzenlenmesi aktin sitoiskeleti2,3,4fonksiyonudur. Kortikal F-aktin T hücreleri dinlenme nispeten statiktir. T-hücre stimülasyon aracılığıyla antijen-ZPT taşıyan aktin sitoiskeleti derin bir düzenlenmesi için yol açar. Aktin dynamics (yani, hızlı aktin polimerizasyon/bozulumu daireler) proteinler veya organelleri, örneğin taşıma için kullanılan kuvvetler oluşturmak T hücreleri etkinleştirin. Ayrıca, aktin sitoiskeleti T hücreleri ve bağışıklık sinaps denilen ZPT, arasında özel bir iletişim bölge geliştirmek için önemlidir. Aktin sitoiskeleti bağışıklık synapse için önemi nedeniyle, bu aktin sitoiskeleti T hücreleri5,6,7,8 değişiklikleri ölçmek için yöntemler geliştirmek için gerekli hale geldi , 9.
Aktin hücre iskeleti yardım sayesinde, bağışıklık synapse içinde (SMACs) supramolecular harekete geçirmek kümelerdeki yüzey reseptörlerinin ve sinyal proteinleri ayrılmış. Bağışıklık synapse kararlılığını reseptörleri aktin sitoiskeleti esnekliğini artırmak F-aktin paketler için bağlama tarafından güvence altına alınmıştır. Edinilmiş bağışıklık yanıtı oluşturmak için kritik olmak bağışıklık synapse oluşumu gösterilmiştir. Arızalı bağışıklık synapse oluşumu içinde vivo zararlı etkilerini ilk Wiskott Aldrich sendromu (WAS), hangi aktin polimerizasyon hastalığında gelen acı hastalarda fark ve kullanılazlar, bağışıklık synapse oluşumu rahatsız10 . Hastalar egzama, şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve melanomlar muzdarip yapıldı. Bu bulgu rağmen Şu anda sağlıklı bireyler ve hastaların acı bağışıklık kusurları veya otoimmün hastalıklar T hücrelerinde farklı bağışıklık synapse oluşumu bilinmemektedir.
Floresans mikroskobu, confocal de dahil olmak üzere, TIRF ve süper çözünürlük mikroskobu, bağışıklık synapse11,12,13,14mimarisini ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Bu sistemlerin yüksek çözünürlüklü ve canlı hücre görüntüleme gerçekleştirme imkanı aktin sitoiskeleti ve bağışıklık synapse yüzey veya hücre içi proteinlerin hakkında tam ve kendisinin zamansal bilgi toplama sağlar. Fazla sonuç, ancak, yalnızca birkaç on T hücrelerinin analizine dayanır. Ayrıca, T hücreleri floresan mikroskopi bu tür için saf olmalı. Ancak, birçok araştırma soruları için mümkün en yüksek çözünürlük yerine unpurified hücreleri kullanımı son derece önemlidir. Bu hastalarda T hücreleri, bağışlanan kan miktarı sınırlıdır ve paralel olarak pek çok örnekleri işlemek için gereken olabilir analiz edilir uygundur.
İnsan sistemi15,16,17bağışıklık synapse aktin sitoiskeleti analizine izin mikroskobik yöntemleri kurduk. Bu yöntemler akış sitometresi akış denetimli mikroskobu18olarak da bilinir, Imaging üzerinde temel alır. Spektral akış sitometresi ve floresan mikroskopi arasında bir melez akış sitometresi Imaging'in morfolojik parametreleri ve pan-lökosit gibi türdeş olmayan hücre popülasyonlarının protein yerelleşme analiz onun güçlü vardır periferik kan. T-hücre/APC conjugates tam kan örneklerinden, zaman alıcı ve pahalı arıtma adımları17, gerek kalmadan insan T hücrelerinin içinde F-aktin ölçmek sağlar bir metodoloji tanıttı. Burada sunulan teknik F-aktin miktar olarak bağışıklık synapse için kan örneği almak tüm iş akışı, oluşmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#62;Multifuge 3 SR</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>#11875085</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Pan Biotech#3302-P101102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352054</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kulturflasche</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#178883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>#8076.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Wash Saponin</td>
			<td></td>
			<td>PBS 1% BSA 0.15 Saponin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReaktiosgefaB</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.699.002</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Bead</td>
			<td>Amnis</td>
			<td>#400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minishaker MS1</td>
			<td>IKA Works</td>
			<td>&#160;MS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrotiterplatte</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>#650101</td>
			<td>96U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enterotoxin SEB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PeTxR</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD0317</td>
			<td>1:30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-AF647</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A22287</td>
			<td>1:150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS100</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Imaging flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSPIRE</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of the immune synapse in the human system using imaging flow cytometry

Bağışıklık synapse T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) arasındaki iletişimi alanıdır. T hücre yüzey reseptörlerinin ve proteinler istikrarlı bir bağlama temin ve Satım sinyal için bağışıklık synapse doğru kutuplaştırmaya. Klasik confocal, TIRF veya Süper çözünürlük mikroskobu bağışıklık synapse eğitim için kullanılmıştır. El ile resim alma ve zaman alıcı miktar bu yöntemler gerektiren bu yana, nadir olayları görüntüleme meydan okuyor. Burada, on binlerce hücre morfolojik analiz sağlayan bir iş akışı açıklanmaktadır. Bağışıklık sinapslarda pan-lökosit müstahzarları birincil insan T hücreleri ve Staphylococcus aureus enterotoxin B SEB-yüklü Raji hücreleri arasında ZPT indüklenen vardır. Resim alma akış sitometresi özelliklerini barındıran bir akış sitometresi ve floresan mikroskop akış denetimli mikroskobu olarak da bilinir, Imaging ile gerçekleştirilir. T hücre/APC çiftler belirlenmesi ve bağışıklık sinapslarda analiz tam bir perdeleme strateji sağlanır. Bu iş akışı bağışıklık Analizi synapses unpurified pan-lökosit hazırlıkları ve dolayısıyla kan sadece küçük bir birim gerektiriyor verdiğinden (yani, 1 mL), Bu hastalardan örnekleri için uygulanabilir. Önemlisi, çeşitli örnekleri hazır, ölçülebilir ve buna paralel olarak analiz.

Protein zenginleştirme miktar önemli hedefidir burada açıklanan yöntemi (örneğin, F-aktin) arasında bağışıklık synapse içinde ZPT (Raji hücreleri) ve T hücrelerinin unpurified pan-lökosit düşük hacimli (1 mL) insan kanı örnekleri alınan vekil. Ekran görüntüsü Şekil 1 ' deki kritik gating strateji bu yöntemin genel bir bakış verir. Sol ve sağ (Şekil 1) analiz alanı resim galerisi gösterir. Resim galerisi "Odak" k...

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Bu yöntem, lökositler arasındaki iletişimin moleküler ve hücresel düzeyde nasıl oluştuğu gibi insan immünolojik alanındaki temel soruların yanıtlatIlmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, saflaştırılmamış insan T hücrelerinin nispeten kısa bir süre içinde ex vivo analiz edilebilmektedir. Bu prosedürü gösteren Henning Kirchgessner, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.50 mililitrelik konik tüp içinde 30 mililitre ACK lysis tampon ile taze çekilmiş insan periferik kan bir mililitre karıştırarak başlayın. Oda sıcaklığında sekiz dakika sonra, bir santrifüj yıkama için PBS ile tüp doldurun ve 37 santigrat derece 60 dakikalık kuluçka için kültür orta iki mililitre pelet resuspend. Kuluçka sonunda, beş kez 10 beşinci Staphylococcus aureus enterotoxin B veya SEB yüklü veya boşraji hücreleri kültür ortamının 500 mikrolitre bireysel FACS tüpleriçine ekleyin, pan-lökosit 650 mikrolitre takip.Ortak kültürlerden aşağı dön ve 150 mikrolitre taze kültür ortamındaki peletleri 37 santigrat derecede 45 dakikalık bir kuluçka için yeniden askıya alın. Daha sonra, 100 rpm'de 10 saniye boyunca hücreleri hafifçe girdap ederken 1,5 mililitre lik 1,5 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, pbs bir mililitre ile fiksasyon durdurmak 1% BSA ile takviye ve santrifüj ile hücreleri toplamak.PBS artı BSA ve % 0.1 saponin 100 mikrolitre pelet resuspend ve 96-iyi, U-alt plaka iki ayrı kuyuiçin hücre örnekleri ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, plakayı santrifüj edin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakikalık bir kuluçka için florofofor konjuge antikorlar veya ilgi bileşikleri içeren PBS artı BSA ve saponin 50 mikrolitre pelet resuspend. Kuluçka sonunda, pbs artı BSA ve saponin 150 mikrolitre hücreleri üç kez yıkayın ve PBS 60 mikrolitre pelet resuspend.Akış sitometrisine göre hücreleri görüntülemek için analiz yazılımını açın, sıvı seviyesini kontrol edin ve Enstrüman menüsünde Başlangıç'ı tıklatın. Ardından, Yükle'yi tıklatın ve istendiğinde örnekleri bağlantı noktasına yükleyin. Aydınlatma sekmesi altında, uyarma lazer gücünü uygun nanometre uzunluklarına değiştirin.Ardından, 4 ve 11 numaralı kanallar için kapıları ayarlayın ve alanı kanal bir için ayarlayın. Gating ve lazer güç ayarlamalarını değerlendirmek için, Görünüm menüsünü ilgili kapıya geçin ve hücreler ve hücre çiftleri görünene kadar kapıları ve lazer güçlerini ayarlayın. Daha sonra, Dosya Edinme sekmesinde, örnek adı ve elde etmek için görüntü sayısını ve CD3 boyama için uygun kapıyı tanımlayın ve edinmeye başlamak için Edinme'yi tıklatın.Edinilmiş hücre görüntülerini analiz etmek için uygun analiz yazılımını açın. Tazminat açılır durumdaki yönergeleri izleyerek, bir telafi matrisi üretin ve matrisi comp tarih ctm olarak kaydedin. Ardından, örnek bir ham resim dosyasını açın ve telafi edilmiş görüntü ve varsayılan veri analizi dosyalarını oluşturmak için penceredeki comp tarih ctm'sini uygulayın.Telafi edilen resim dosyalarını açtıktan sonra, görüntüleri renk moduna dönüştürün. Resim Galerisi Özellikleri araç çubuğunda en uygun görünür renkleri elde etmek için arama tablolarını ayarlayın. Çözümleme menüsünde Maske Yöneticisi'ni açın ve kanal beş için %60 Eşik maskesi seçerek ve T hücre maskesi oluşturmak için maskeyi doldurarak T hücrelerini tanımlayın.Ardından, Vadi maskesioluşturmak için üç piksel genişliğinde kanal iki için Vadi maskesini seçin ve T hücresi ve Vadi maskelerini birleştirerek T hücre sinaps maskesini oluşturun. T hücrelerindeki toplam CD3 ifadesini hesaplamak için Özellik Yöneticisi'ni açın ve Yoğunluk, T hücresi, kanal beş özelliğini oluşturun. T hücrelerindeki toplam F-aktin miktarını hesaplamak için Yoğunluk, T hücreleri, kanal altı özelliğini oluşturun.Bağışıklık sinapslarında CD3 miktarını değerlendirmek için Yoğunluk, T hücre sinaps, kanal beş özelliğini oluşturun. Bağışıklık sinapstaki F-aktin miktarını belirlemek için Yoğunluk, T hücre sinaps, kanal altı özelliğini oluşturun. Son olarak, F-aktin ve CD3 zenginleştirme tanımlamak için, f-aktin veya CD3 oranını bağışıklık sinaps ve seçilen proteinin toplam ifade, sırasıyla hesaplamak.Bu grafiklerde, vekil antijen sunan hücreler veya AAP'ler arasındaki immün sinapsprotein zenginleştirme ölçmek için kritik gating stratejisinin bir bakış, veya AAP'ler, ve düşük hacimli insan kan örneğinden alınan saflaştırılmamış pan-lökositler T hücreleri gösterilmiştir. Burada, SEB yokluğunda bağışıklık sinapsları içinde CD3 ve F-actin düşük seviyelerde T-hücre-APC conjugates temsili görüntüler gösterilir, bu T-hücre-APC konjugatseb SEB varlığında güçlü bir CD3 ve F-actin zenginleştirme gösterirken. Süperantijen yokluğunda, T hücrelerinin %15'i immün sinapsta hem CD3 hem de F-aktin zenginleştirme sergilerken, süperantijen varlığında %29'luk bir zenginleştirme gözlenmiştir.Gerçekten de, süperantijen yokluğunda, hücrelerdeki toplam F-aktinin %20'sinden azı immün sinapsta birikir ve %30'dan fazlası süperantijen varlığında sinapsta gözlenir. Özellikle, CD3 süperantijen yokluğunda bile bağışıklık sinaps birikir, Bu birikimi de önemli ölçüde superantigen eklenmesi ile artar rağmen, T-hücre-APC bağışıklık sinaps protein birikimini ölçmek için bu yöntemin uygunluğunu gösteren. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa altı ila yedi saat içinde tamamlanabilir.Seb'siz AKIK'lar kullanıldığında protein zenginleştirme de meydana geldiğinden, bu yordamı denerken, süperantijen içermeyen numuneler de dahil olmak üzere ilgili tüm kontrolleri eklemeyi unutmamak önemlidir. Bu işlemden sonra, süper çözünürlüklü mikroskopi gibi diğer yöntemler immün sinaps ince yapısı hakkında ek sorulara cevap için yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra hücresel iletişim alanındaki araştırmacıların temel araştırmalar, klinik çalışmalar ve çeviri bilimi için insanlardaki bağışıklık sinapsını keşfetmelerinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, insan T hücreleri ex vivo T-hücre-APC bağ bölgesi ve bağışıklık sinaps analiz etmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Birincil insan malzemeleriile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve eldiven takmak veya biyogüvenlik seviyesi altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...