Name: reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

بفضل مؤلف الدكتور فيليب Selenko (FMP-برلين) لتوفير مساحة الرطب مختبر والبنية التحتية لإجراء تجارب والألمانية للبحوث (DFG) لتمويل العمل من خلال منحة بحثية (LI 2402 / 2-1).

1. إعادة تشكيل جسيم نووي مع تفاضلي النظائر المسمى (والتعديل غير متماثلة) الأخت الهستونات ملاحظة: يصف البروتوكول الحالي إعادة تشكيل جسيم نووي مع تفاضلي المسمى النظير هيستون H3. ولهذه الغاية، تم استخدام اثنين من حمامات من H3 هيستون...

<ol>
	<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution:+Determinants,+Mechanisms,+and+Functions.">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes.">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications.">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Language+of+Histone+Crosstalk.">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events.">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li><li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetrically+Modified+Nucleosomes.">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications.">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection,+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy.">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li><li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+&#945;-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites.">Intracellular repair of oxidation-damaged &#945;-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251 (2016).</li><li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds.">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling,+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy.">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA.">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy+:SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li><li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy.">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li><li>St&#252;tzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails.">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li><li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+K16Q+Mutation,+an+Acetylation+Mimic,+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome.">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts.">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins.">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy.">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li><li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes.">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li></ol>

لإعادة جسيم نووي، البروتوكول الحالي يستخدم 165 نقطة أساس القالب الحمض النووي طويلة تحتوي على 601 ويدوم المواقع جسيم نووي تسلسل 20، ولكن من المتوقع أداء مماثل باستخدام أطوال مختلفة من قوالب الحمض النووي. تم تصميم بروتوكول ويعمل باستخدام أنواع غير المتماثلة ...

وتعبئتها الحمض النووي حقيقية النواة بإحكام داخل نواة الخلية إلى لونين. لبنة أساسية من لونين هو الجسيمات الأساسية جسيم نووي يحتوي على ~ 147 شركة بريتيش بتروليوم من الحمض النووي ملفوفة حول مجمع octameric تتكون من نسختين لكل من histones الأساسية الأربعة (H3، H4، H2A، H2B). البروتينات هيستون تؤوي مجموعة كبيرة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). هذه التبديلات التساهمية تحفز تغييرات في هيكل الكروماتين، سواء بصورة مباشرة أو عن طريق التأثير على الكيمياء الفيزيائية للنظام وبشكل غير مباشر من خلال تجنيد أنشطة إعادة عرض لونين 1، 2، 3. من خلال هذه الوسائل، PTMs هيستون تسيطر الكروماتين الوصول، وبالتالي تنظيم جميع الوظائف الخلوية المعتمدة على الحمض النووي (4). يتم تثبيت PTMs من قبل أنظمة انزيم تعديل هيستون أساسا على قطاعات N-الطرفية غير منظم (ذيول) من HISTO الأساسية أدرجت جسيم نوويالأخبار. بسبب العديد من مواقع تعديل على سلسلة قصيرة نسبيا من ذيول هيستون، PTMs التأثير على بعضهم البعض عن طريق حفز أو منع ردود الفعل تعديل لاحقة، وهو تأثير يعرف باسم تعديل عبر الحديث 5. بسبب بنية متماثلة العامة للجسيم نووي، ويعتقد أن ردود الفعل تعديل وآليات الحديث المتبادل أن يحدث بالمثل على نسختين من كل هيستون nucleosomal (الهستونات شقيقة). وقد تحدى هذا المفهوم مؤخرا ودحضت في وقت لاحق. بشكل خاص، أظهرت فحوصات في المختبر الأنزيمية على هيستون مجانا الببتيدات H3 الذيل وعلى جسيم نووي أن مجموعة من تحركات H3 قدم الفسفرة بطريقة غير المتماثلة 6. بالإضافة إلى ذلك، كشف التحليل LC-MS / MS أساس تقارب تنقية-وجود جسيم نووي غير متماثلة، ميثليته H3 في عدة أنواع من الخلايا حقيقية النواة 7. وهكذا، جسيم نووي تعديل غير متجانس تشكل الأنواع الجديدة، وهناك حاجة إلى أدوات للكشف عن الآليات التي تتحكم في تكوينها وتحليل الآثار الحديث المتبادل أن هذا التباين قد تمارس. عادة، وقد استخدمت الغربية التنشيف (WB) والطيف الكتلي (MS) تحليل للكشف عن PTMs هيستون. وعلى الرغم من تطبيقه سهلا، WB يعاني من مشاكل في الخصوصية / عبر التفاعل. وعلاوة على ذلك، فإنه غير قادر على القيام بها احد تحليل متعدد PTM والمباشر لكمية ردود الفعل تعديل 8. من ناحية أخرى، تحليل MS يعمل الأجهزة المتطورة التي تتطلب تدريبا رفيع المستوى، ولكنها توفر خصوصية عالية، فضلا عن رسم الخرائط في وقت واحد وتقدير من PTMs متعددة 9. &#160; ومع ذلك، على حد سواء الأساليب التخريبية ونأت المجمعات nucleosomal قبل التحليل، مما أدى إلى خليط من الهستونات و / أو الببتيدات المستمدة هيستون. هذا التلاعب يزيل القدرة على التمييز مستقلةردود الفعل التعديل التي تحدث في كل من البلدين الشقيقين الهستونات وتقرير حالة تعديل نسخ معينة من الهستونات nucleosomal. الرنين المغناطيسي (NMR) الطيفي النووي تطورت كطريقة بديلة لرسم خريطة ردود الفعل PTM. NMR غير nondisruptive وبالتالي يسمح للرصد الأحداث PTM بطريقة الوقت الحقيقي في خليط من تشكيلها، وحتى في خلايا سليمة 10 و 11. تطوير إجراءات للحصول على البيانات بسرعة وكذلك لرسم الخرائط عالية الدقة على أساس 2D طرق ارتباط-مغاير النووي من عينات المسمى النظير (15 N و / أو 13 C) 12 يسمح تعيين وقت واحد من أنواع مختلفة من PTMs، مثل كما سيرين / ثريونين / الفسفرة التيروزين، أستلة يسين / مثيلة، وأرجينين مثيلة 13. اعتمادا على PTM قيد التحقيق، 15 N- أو 13 C-وضع العلامات والعلاقات العامةيمكن استخدامها otocols للاحتفال مجموعة وظيفية البروتين الذي يعمل كمراسل تعديل. ونتيجة لذلك، ورسم الخرائط PTM لا يمكن أن يؤديها من خلال اتباع مميزة النزوح التحول الكيميائي للمجموعة وظيفية المقابلة &quot;الاستشعار عن بعد&quot; للتغيير في البيئة الكيميائية. في معظم الحالات، سواء NH والمجموعات الكيميائية CH يمكن استخدامها للإبلاغ عن تطور PTM من الفائدة. يصف البروتوكول الحالي توليد جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. فهو يجمع بين المرونة في مطيافية الرنين النووي المغناطيسي لرسم خريطة PTMs باستخدام كل 1 ح 15 N و 1 ح 13 ج ارتباط الأطياف مع الاستفادة من مختلف العلامات البروتين تقارب لتنقية المجمعات هيستون المعاد المحدد. والجدير بالذكر أن يستخدم بروتوكول اثنين من تجمعات مختلفة من هيستون خاص لإعادة جسيم نووي. هذه المجمعات تفاضلي المسمى النظائر (واحد مع <suص&gt; 15 N، والآخر مع 13 C)، وأنها تنصهر إلى polyhistidine وعلامة streptavidin تقارب، على التوالي. وجنبا إلى جنب تقارب نظام تنقية مع ني NTA واللوني القائم على streptavidin استخدمت في البداية من قبل فويت وآخرون. يعمل 7 لتنقية الأنواع غير المتماثلة من نظرائهم متماثل (الشكل 1A). تستخدم octamers هيستون غير المتماثلة في وقت لاحق لإعادة المجمعات nucleosomal أي ما يعادل (الشكل 1B)، وذلك باستخدام الملح القياسية طريقة غسيل الكلى 14. بالإضافة إلى ذلك، من خلال نفس الإجراء وجود واحدة من برك هيستون قبل تعديلها، وPTM يمكن إدراجها غير متماثلة على جسيم نووي الناتجة عن ذلك. رد فعل هذه ركائز باستخدام إنزيمات تعديل هيستون ولاحق NMR رسم خرائط للأحداث تعديل تمكين توصيف آليات الحديث المتبادل على حد سواء في رابطة الدول المستقلة (premodified نسخة هيستون) وفي العابرة (unmodifiإد هيستون نسخة) (الشكل 1C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Unfolding Buffer</td>
			<td>7M guanidinium HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refolding Buffer</td>
			<td>10mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>25mM NaxHxPO4 pH6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium HCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A14199</td>
			<td>Use high quality Gu-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1034557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1207-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-probe antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-tactin conjugated HRP</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1502-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Load 16/600 Superdex 200pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 1, 132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 7, 132129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution-state NMR spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

جسيم نووي تعديل غير متماثلة يحتوي على نسختين من هيستون (الهستونات شقيقة) مزينة مجموعات متميزة من التعديلات بعد متعدية (PTMs). يتم التعرف عليهم حديثا أنواع وسائل غير معروفة من إنشاء والآثار الوظيفية. الأساليب التحليلية الحالية غير كافية للكشف عن حدوث-نسخة محددة من PTMs على الهستونات شقيقة nucleosomal. ويعرض هذا البروتوكول طريقة الكيمياء الحيوية لإعادة في المختبر من جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. مجمع الناتجة يمكن أن يكون أيضا تعديل غير متماثلة، بعد بما في ذلك حمام هيستون premodified خلال refolding من subcomplexes هيستون. ويمكن لهذه الاستعدادات جسيم نووي غير المتماثلة يكون بسهولة كان رد فعل مع إنزيمات تعديل هيستون لدراسة الآليات عبر الحديث التعديل الذي فرضته PTM غير متماثلة قبل إدراجها باستخدام التحليل الطيفي النووي بالرنين المغناطيسي (NMR). بشكل خاص، ردود فعل التعديل فيفي الوقت الحقيقي يمكن تعيين بشكل مستقل على اثنين من الهستونات الشقيقة عن طريق إجراء أنواع مختلفة من التجارب علاقة الرنين النووي المغناطيسي، مصممة خصيصا لنوع النظير منها. توفر هذه المنهجية وسيلة لدراسة آليات الحديث المتبادل التي تساهم في تشكيل وانتشار أنماط PTM غير المتماثلة على المجمعات nucleosomal.

يتم عزل الأنواع octameric refolded بشكل صحيح بعد سلسلة من الخليط إعادة من خلال عمود هلام الترشيح (الشكل 2). يتعرض تجمع أعيد octameric تحتوي على ثلاثة أنواع مختلفة من octamers إلى مخطط جنبا إلى جنب تنقية تقارب. يتم جمع عينات من جميع الخطوات وتحليلها بواسطة SDS-PAG...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

يصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل جسيم نووي يحتوي على تفاضلي الهستونات شقيقة المسمى النظير. وفي الوقت نفسه، جسيم نووي تعديل غير متماثلة بعد translationally يمكن أن تتولد بعد استخدام نسخة هيستون premodified. هذه الاستعدادات يمكن استخدامها بسهولة لدراسة آليات التعديل المتبادل، في وقت واحد في كل من الهستونات الشقيقة، وذلك باستخدام عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي.

إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

تحديد إذا كان الحمض النووي ملطخة "سينين صبغ يمكن هضمها" مع إنزيمات التقييد

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...