Name: reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00
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Der Autor dankt Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) für die Nasslaborfläche Bereitstellung von Infrastruktur und zur Durchführung Experimente und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung der Arbeit durch ein Forschungsstipendium (LI 2402 / 2-1).

1. Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten (und Asymmetrisch Modified) Schwester Histone Hinweis: Das aktuelle Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen mit unterschiedlich isotopenmarkierten Histon H3. Zu diesem Zweck wurden zwei Pools von Histon H3 verwendet wird; war 15 N-markierte und enthielt einen 6xHis-Tag am N-Terminus und die zweite war 13 C-markiertem und enthielt die Strep - Peptid (WSHPQFEK) am N-Terminus fusion...

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Für Nukleosomen Rekonstitution verwendet das aktuelle Protokoll , um eine 165 bp lange DNA - Vorlage , um die 601-Widom Nukleosomen Positioniersequenz 20, aber eine ähnliche Leistung wird erwartet , dass mit verschiedenen Längen von DNA - Matrizen enthalten. Das Protokoll wurde entworfen und verwendet unter Verwendung asymmetrischer Arten von Histon H3. Mit dem gleichen Prinzip kann das Verfahren auch für die anderen Core-Histone angewendet werden und zusätzlich verwendet werden können Komp...

Eukaryotische DNA ist eng in die Zellkerne in Chromatin verpackt. Der grundlegende Baustein des Chromatins ist die Nukleosomen Kernteilchen, die ~ 147 bp DNA um einen oktameren Komplex, bestehend aus zwei Kopien jeder der vier Core-Histone (H3, H4, H2A, H2B) gewickelt enthält. Histon-Proteine ​​beherbergen eine Vielzahl von Post-translationale Modifikationen (PTM). Diese kovalente Substitutionen induzieren Veränderungen in der Chromatinstruktur, sowohl direkt durch die physikalische Chemie des Systems zu beeinflussen und indirekt durch die Einstellung von Chromatin-Remodeling - Aktivitäten 1, 2, 3. Durch diese Mittel steuern Histon PTMs Chromatin Zugänglichkeit und damit regeln alle DNA-basierten zellulären Funktionen 4. PTM werden von Histon-modifizierenden Enzymsysteme vor allem auf die unstrukturierte N-terminalen Segmente (Schwänze) von Nukleosomen-Kern integriert histo installiertang. Aufgrund der vielen Modifikationsstellen auf der relativ kurzen Sequenz von Histon - tails beeinflussen PTMs einander durch Induzieren oder nachfolgenden Modifikationsreaktionen zu blockieren, eine Wirkung als Modifikationsübersprechens 5 bekannt. Aufgrund der insgesamt symmetrischen Architektur der Nukleosomen, Modifikationsreaktionen und Übersprechmechanismen wurden gedacht, um in ähnlicher Weise auf die zwei Kopien von jedem nukleosomalen Histon (Schwester Histone) auftreten. Dieses Konzept wurde vor kurzem in Frage gestellt und später widerlegt. Insbesondere zeigten in vitro enzymatische Tests auf freien Histon H3 Schwanz Peptide und auf Nukleosomen , dass eine Reihe von H3 - Kinasen 6 - Phosphorylierung in asymmetrischer Weise eingeführt. Zusätzlich Affinitätsreinigung basierten LC-MS / MS - Analyse zeigte das Vorhandensein von unsymmetrisch H3-methylierten Nukleosomen in verschiedene Arten von eukaryotischen Zellen 7. Somit bilden asymmetrisch modifizierten Nukleosomen neuartige Arten undWerkzeuge nötig sind, um die Mechanismen aufzudecken, die ihre Bildung steuern und die Übersprecheffekte zu analysieren, dass diese Asymmetrie ausüben könnten. Üblicherweise wurden Western Blot (WB) und Massenspektrometrie (MS) -Analyse verwendet Histon PTMs zu detektieren. Trotz seiner einfachen Anwendung, leidet WB aus Spezifität / Kreuzreaktivität Probleme. Hinzu kommt, dass ist es nicht in der Lage 8 simultane Multi-PTM Analyse und direkte Quantifizierung der Modifikationsreaktionen durchzuführen. Auf der anderen Seite beschäftigt MS - Analyse ausgefeilte Instrumentierung , die Ausbildung auf hohem Niveau erfordert, bietet aber eine hohe Spezifität sowie gleichzeitige Kartierung und Quantifizierung von mehreren PTM 9. &#160; Jedoch sind beide Verfahren disruptive und die nukleosomalen Komplexe vor der Analyse dissoziiert, zu einer Mischung von Histonen und / oder Histon abgeleiteten Peptiden führt. Diese Manipulation entfernt die Möglichkeit, unabhängig zu unterscheidenModifikationsreaktionen, die auf jeder der beiden Schwester Histone auftreten und die Kopie spezifischen Modifikation Status der nukleosomalen Histone zu melden. Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie als alternative Methode entwickelt PTM Reaktionen zuzuordnen. NMR ist eine unterbrechungsfreie und ermöglicht so die Kontrolle der PTM Ereignisse in einer Echtzeit - Weise in rekonstituierten Mischungen und sogar in intakten Zellen 10, 11. Die Entwicklung von Routinen zur schnellen Datenerfassung sowie für hochauflösende Abbildung basierend auf 2D heteronuklearen Korrelationsverfahren von isotopenmarkierten (15 N und / oder 13 C) Proben 12 erlaubt die gleichzeitige Abbildung von verschiedenen Arten von PTMs, beispiels als Serin / Threonin / Tyrosin - Phosphorylierung, Acetylierung Lysin / Methylierung und Arginin Methylierungs 13. In Abhängigkeit von der PTM untersuchten 15 N- oder 13 C-Kennzeichnung protocols kann das Protein funktionelle Gruppe zu markieren, die verwendet werden als eine Modifikation Reporter dient. Folglich kann PTM-Mapping durch Befolgen der charakteristischen chemischen Verschiebung Verschiebung der entsprechenden funktionellen Gruppe durchgeführt werden &quot;Erfassen&quot;, um die Änderung in der chemischen Umgebung. In den meisten Fällen sowohl NH und CH chemischen Gruppen können die Entwicklung des PTM von Interesse zu berichten, verwendet werden. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Erzeugung von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Es kombiniert die Flexibilität der NMR - Spektroskopie PTM zur Karte sowohl 1 H- 15 N und 1 H- 13 C - Korrelationsspektren mit der Nutzung von verschiedenen Protein - Affinität - Tags für die Reinigung der rekonstituierten ausgewählten Histon - Komplexen. Bemerkenswert ist, verwendet das Protokoll, das zwei verschiedene Pools eines bestimmten Histon für Nukleosomen Rekonstitution. Diese Pools sind unterschiedlich isotopenmarkierten (eins mit <sup&gt; 15 N, die andere mit 13 C), und sie sind mit einem Polyhistidin fusionierte und einem Streptavidin Affinitätstag, respectively. Ein Tandem - Affinitätsreinigung Schema mit Ni-NTA und Streptavidin-basierte Chromatographie zunächst von Voigt et al. 7 verwendet wird , aus symmetrischen Pendants (1A) asymmetrische Spezies zu reinigen. Asymmetrische Histon Octamere werden anschließend zu rekonstituieren äquivalente nukleosomalen Komplexe (1B), unter Verwendung des Standardsalzdialyseverfahren 14 verwendet. Zusätzlich wird durch das gleiche Verfahren und durch eine der Histon-pools vormodifizierten aufweist, kann eine PTM asymmetrisch auf die resultierende Nukleosomen eingearbeitet werden. Die Umsetzung dieser Substrate mit Histon-modifizierende Enzyme und anschließender NMR-mapping Modifikations Ereignisse ermöglichen die Charakterisierung von Übersprechmechanismen sowohl in-cis (vormodifiziert Histon - copy) und in-trans (unmodified Histon - Kopie) (Abbildung 1C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Unfolding Buffer</td>
			<td>7M guanidinium HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refolding Buffer</td>
			<td>10mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>25mM NaxHxPO4 pH6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium HCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A14199</td>
			<td>Use high quality Gu-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1034557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1207-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-probe antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-tactin conjugated HRP</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1502-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Load 16/600 Superdex 200pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 1, 132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 7, 132129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution-state NMR spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

Asymmetrisch modifizierte Nukleosomen enthalten die beiden Kopien eines Histon (Schwester Histone) dekoriert mit unterschiedlichen Mengen von Post-translationale Modifikationen (PTM). Sie sind neu Spezies mit unbekannten Mitteln Niederlassungs- und funktionelle Auswirkungen identifiziert. Aktuelle analytische Methoden sind unzureichend, um die Kopie spezifische Auftreten von PTM auf die nukleosomalen Schwester Histone zu erkennen. Dieses Protokoll stellt ein biochemisches Verfahren zur in vitro Rekonstitution von Nukleosomen differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Der erzeugte Komplex kann auch asymmetrisch modifiziert werden, nachdem ein vormodifizierter Histon-Pool auch während der Histon Subkomplexe Neufaltung. Diese asymmetrischen Nukleosom Zubereitungen können leicht umgesetzt werden, mit Histon-modifizierende Enzyme Modifikation Übersprechens Mechanismen durch die asymmetrisch vorge eingebaut PTM unter Verwendung der kernmagnetischen Resonanz (NMR) -Spektroskopie auferlegt zu studieren. Insbesondere sind die Modifizierungsreaktionen inEchtzeit kann durch die Durchführung verschiedener Arten von NMR-Korrelationsexperimente, zugeschnitten für das jeweilige Isotop Typ unabhängig von den beiden Schwester Histone abgebildet werden. Diese Methode liefert die Mittel Übersprechmechanismen zu untersuchen, die zur Bildung und Ausbreitung von asymmetrischen PTM Muster auf nukleosomalen Komplexe beitragen.

Richtig rückgefaltetem oktamere Arten werden nach einem Durchlauf der Rekonstitution Mischung durch eine Gelfiltrationssäule (Abbildung 2) isoliert. Die gebrauchsfertige oktameren Pool die drei verschiedenen Arten von Octamere enthält, wird auf dem Tandem-Affinitätsreinigung Schema unterworfen. Proben werden aus allen Schritten und durch SDS-PAGE und anschließend WB gesammelt. Überprüfung der korrekten Ausführung des Protokolls , das bei der Isolierung von asymme...

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Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Forschung

Biochemie

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

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In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

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Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...