Name: reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

המחבר מודה ד&quot;ר פיליפ Selenko (FMP-ברלין) למתן שטח רטוב המעבדה ותשתיות לבצע ניסויים (DFG) למימון עבודה באמצעות מענק מחקר (LI 2402 / 2-1).

כינון 1. נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו (ו סימטרי השתנה) היסטונים אחות הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום עם H3 היסטון איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. לשם כך, שתי בריכות של היסטון H3 שימשו; אחד היה 15</sup...

<ol>
	<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution:+Determinants,+Mechanisms,+and+Functions.">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes.">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications.">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Language+of+Histone+Crosstalk.">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events.">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li><li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetrically+Modified+Nucleosomes.">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications.">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection,+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy.">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li><li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+&#945;-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites.">Intracellular repair of oxidation-damaged &#945;-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251 (2016).</li><li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds.">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling,+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy.">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA.">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy+:SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li><li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy.">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li><li>St&#252;tzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails.">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li><li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+K16Q+Mutation,+an+Acetylation+Mimic,+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome.">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts.">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins.">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy.">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li><li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes.">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li></ol>

עבור הכינון מחדש הנוקלאוזום, הפרוטוקול הנוכחי מנצל תבנית ה- DNA ארוכה 165 נ&quot;ב המכיל את רצף מיצוב הנוקלאוזום 601-Widom 20, אבל ביצועים דומים צפוי באמצעות באורכים שונים של תבניות DNA. הפרוטוקול נועד והעסיק באמצעות סוגים סימטריים של היסטון H3. עם אותו העיקרון, השיטה ...

DNA איקריוטיים ארוז היטב בתוך גרעין התא אל הכרומטין. אבן הבניין הבסיסית של הכרומטין הוא חלקיק הליבה הנוקלאוזום המכיל ~ 147 נ&quot;ב של DNA עטוף סביב תסביך octameric מורכב משני עותקים כל אחד מארבעת ההיסטונים הליבה (H3, H4, H2A, H2B). חלבוני היסטון נמל שפע של שלאחר translational שינויים (PTMs). החלפות קוולנטיים אלה לגרום שינויים במבנה הכרומטין, הוא באופן ישיר על ידי המשפיע על הכימיה הפיסיקלית של המערכת ובעקיפין על ידי גיוס פעילויות שיפוץ-הכרומטין 1, 2, 3. באמצעות אלה, PTMs היסטון לשלוט נגישות הכרומטין, ומכאן, להסדיר את כל הפונקציות הסלולר מבוססי DNA 4. PTMs מותקנים על ידי מערכות אנזימים שינוי היסטון בעיקר על ערוצי N-terminal לא מובנה (זנבות) של histo הליבה-משולב הנוקלאוזוםנוס. בשל באתרי השינוי הרבים על הרצף קצר יחסית זנבות היסטון, PTMs להשפיע אחד על השני על ידי גרימה או חסימת תגובות מפני עריכה, תופעה הידועה בשם 5 הצטלבות שינוי. בגלל הארכיטקטורה הסימטרית הכוללת של הנוקלאוזום, תגובות שינוי ומנגנוני crosstalk נחשבו להתרחש באופן דומה על שני העותקים של כל היסטון nucleosomal (היסטונים אחות). מושג זה היה לערער לאחרונה ובהמשך להפרכה. במיוחד, במבחנת מבחני האנזימטית על פפטידים זנב H3 חינם היסטון ועל נוקלאוזום הוכיחו כי קבוצה של קינאזות H3 הציגה זירחון בתוך סימטרי באופן 6. בנוסף, זיקת טיהור מבוססת LC-MS / MS ניתוח חשף את קיומם של סימטרית נוקלאוזום-מפוגל H3 בכמה סוגים של תאים איקריוטיים 7. לפיכך, סימטרי נוקלאוזום שונה מהווה מיני רומן,כלים נדרשים לחשוף את המנגנונים השולטים היווצרותם ולנתח את ההשפעות crosstalk שחוסר סימטריה זה עלול להפעיל. בדרך כלל, המערבי סופג (WB) ו ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח שימשו כדי לזהות PTMs היסטון. למרות היישום הקל שלה, WB סובל סגוליים / בעיות תגובתיות צולבות. נוסף על כך, זה אינו מסוגל לבצע ניתוח רב-PTM סימולטני וכימות ישירה של תגובות השינוי 8. מצד השני, ניתוח MS מעסיק מכשור מתוחכם הדורש הכשרה ברמה גבוהה, אך מספק סגולי גבוהות כמו גם מיפוי סימולטני וכימות של מספר 9 PTMs. &#160; עם זאת, שתי השיטות הן משבשות מתחמי nucleosomal הם ניתקו לפני הניתוח, והולידו תערובת של ההיסטונים ו / או פפטידים שמקורם היסטון. מניפולציה זו מסירה את היכולת להבחין עצמאיתגובות שינוי המתרחשות על כל אחד משני ההיסטונים אחותו לדווח על מצב שינוי ספציפי העותק של ההיסטונים nucleosomal. תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה התפתחה כמו שיטה חלופית כדי למפות תגובות PTM. התמ&quot;ג הוא הפרעה ובכך מאפשרת ניטור של אירועים PTM באופן בזמן אמת בתערובות מחדש, ואפילו תאים שלמים 10, 11. הפיתוח שגר לרכישת נתונים מהירה וכן למיפוי ברזולוציה גבוהה המבוסס על 2D שיטות קורלציה הטרו-הגרעיני של שכותרתו איזוטופ (15 N ו / או 13 ג) דגימות 12 אפשרו המיפוי סימולטני של סוגים שונים של PTMs, כגון כמו סרין / תראונין / זירחון טירוזין, acetylation ליזין / מתילציה, ו ארגינין מתילציה 13. בהתאם PTM תחת חקירה, 15 N- או 13 יח&quot;צ C-תיוגיכול להיות מועסק otocols לסמן את הקבוצה פונקציונלי חלבון המשמש ככתב שינוי. כתוצאה מכך, מיפוי PTM יכול להתבצע על ידי ביצוע עקירת המשמרת כימית מאפיינת את הקבוצה הפונקציונלית המתאימה &quot;חישה&quot; השינוי על הסביבה הכימית. ברוב המקרים, הוא NH וקבוצות כימיות CH ניתן המשמשים לצורכי דיווח על האבולוציה של PTM של עניין. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הוא משלב את הגמישות של ספקטרוסקופיה NMR למפה PTMs הן באמצעות ספקטרום קורלציה 1 H- 15 N ו- 1 H- 13 C עם ניצול של תגי קרבה חלבון שונים לטיהור של מתחמי היסטון מחדש שנבחרו. יש לציין, כי הפרוטוקול מעסיק שתי ברכות שונות של היסטון בפרט עבור כינון מחדש הנוקלאוזום. בריכות אלו הן איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי (אחד עם <sup&gt; 15 N, השני עם 13 C), והם התמזגו polyhistidine ותג זיקה streptavidin, בהתאמה. ערכת טיהור זיקה טנדם עם Ni-נ.ת.ע כרומטוגרפיה מבוסס streptavidin בתחילה שמוצגת וויגט et al. 7 מועסק לטהר מינים סימטריים מעמיתיהם סימטריים (איור 1 א). Octamers היסטון אסימטרית משמש לאחר מכן כדי לשקם מתחמי nucleosomal שווים ערך (איור 1B), בשיטת דיאליזת המלח הרגיל 14. בנוסף, דרך אותו ההליך ועל ידי שיש אחת הבריכות היסטון מראש שונה, PTM ניתן לשלב סימטרי על נוקלאוזום שהתקבל. התגובה של אלה מצעים עם אנזימי שינוי היסטון ו- NMR-המיפוי הבא של אירועי שינוי לאפשר אפיון מנגנוני crosstalk הוא-cis (עותק היסטון premodified) וב-טרנס (unmodifiעותק היסטון ed) (תרשים 1C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Unfolding Buffer</td>
			<td>7M guanidinium HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refolding Buffer</td>
			<td>10mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>25mM NaxHxPO4 pH6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium HCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A14199</td>
			<td>Use high quality Gu-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1034557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1207-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-probe antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-tactin conjugated HRP</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1502-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Load 16/600 Superdex 200pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 1, 132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 7, 132129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution-state NMR spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

נוקלאוזום שונה סימטרית מכילים שני עותקים של היסטון (היסטונים אחות) מעוטר סדרות שונות של שלאחר translational שינויים (PTMs). הם לא מכבר מזוהה מינים באמצעים לא ידועים של קמת השלכות תפקודיות. שיטות אנליטיות נוכחיות אינן מספיקות כדי לזהות את המופע ספציפי העותק של PTMs על ההיסטונים אחות nucleosomal. פרוטוקול זה מציג שיטה ביוכימיים בריאורגניזציה במבחנה של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הקומפלקס שנוצר יכול להיות גם סימטרית שונה, אחרי כולל בריכת היסטון premodified במהלך refolding של subcomplexes היסטון. הכנות הנוקלאוזום הסימטריות אלה יכולים להיות הגיבו בקלות עם אנזימי שינוי היסטון ללמוד מנגנוני שינוי צולב לדבר שטיל PTM מראש שולב הסימטרי באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR). במיוחד, תגובות השינוי בניתן למפות בזמן אמת באופן עצמאי על שני היסטונים אחותו על ידי ביצוע סוגים שונים של ניסויי קורלציה NMR, המותאמים לסוג איזוטופ בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת את האמצעים כדי לחקור מנגנוני crosstalk שתורמים להיווצרות ההתפשטות של דפוסי PTM סימטריים על מתחמי nucleosomal.

כראוי וקפלו מיני octameric מבודדים אחרי ריצה של תערובת הכינון מחדש דרך עמודת סינון ג&#39;ל (איור 2). הבריכה מחדש octameric המכיל את שלושת הסוגים השונים של octamers הוא נתון את ערכת טיהור זיקה טנדם. דוגמאות נאספות מכל המדרגות ונותחו על ידי SDS-PAGE, ובהמשך WB. אימ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...