Name: reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Forfatteren takket Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) for å gi wet-lab plass og infrastruktur for å utføre eksperimenter og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) for å finansiere arbeidet gjennom et forskningsstipend (LI 2402 / 2-1).

1. Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket (og asymmetrisk modifisert) Sister Histoner MERK: Den aktuelle protokollen beskriver tilberedning av nukleosomer med forskjellig isotop-merkede histon H3. For å oppnå dette, ble to bassenger av histon H3 som brukes; en var 15 N-merket og inneholdt en 6xHis-tag ved N-terminalen og den andre var 13 C-merket og inneholdt Strep peptid (WSHPQFEK) fusjonert ved N-terminus. Begge kodene ble skilt fra de innfø...

<ol>
	<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution:+Determinants,+Mechanisms,+and+Functions.">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes.">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications.">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Language+of+Histone+Crosstalk.">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events.">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li><li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetrically+Modified+Nucleosomes.">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications.">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection,+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy.">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li><li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+&#945;-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites.">Intracellular repair of oxidation-damaged &#945;-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251 (2016).</li><li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds.">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling,+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy.">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA.">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy+:SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li><li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy.">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li><li>St&#252;tzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails.">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li><li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+K16Q+Mutation,+an+Acetylation+Mimic,+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome.">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts.">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins.">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy.">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li><li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes.">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li></ol>

For nucleosome tilberedning, utnytter dagens protokollen en 165 bp lang DNA-templat som inneholder 601-Widom nucleosome posisjonering sekvens 20, men tilsvarende ytelse er forventet ved hjelp av ulike lengder av DNA-maler. Protokollen ble designet og ansatt ved hjelp av asymmetriske typer histon H3. Med det samme prinsipp kan fremgangsmåten anvendes også for andre kjerne histoner og i tillegg kan brukes til blanding av komplekser som bærer to adskilte kjerne histoner med forskjellige isotoper ...

Eukaryote DNA er tett pakket i cellekjerner i kromatin. Den grunnleggende byggesten av kromatin er nucleosome kjernepartikkel som inneholder ~ 147 bp DNA pakket rundt en octameric kompleks som består av to eksemplarer hver av de fire kjerne histoner (H3, H4, H2A, H2B). Histonproteinene havn en mengde posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs). Disse kovalente substitusjonene indusere endringer i kromatinstruktur, både direkte ved å påvirke den fysiske kjemien i systemet og indirekte ved å rekruttere kromatin-remodeling aktiviteter 1, 2, 3. Ved disse midler, histon PTMs tak kromatin tilgjengeligheten og dermed regulere alle DNA-baserte cellulære funksjoner 4. PTMs installeres av histon-modifisering enzymsystemer i hovedsak på de ustrukturerte N-terminale segmenter (tails) av nucleosome-innlemmet kjerne histones. På grunn av de mange modifikasjons steder på relativt kort sekvens av histone haler, PTMs påvirker hverandre ved å indusere eller blokkere påfølgende modifikasjonsreaksjoner, en effekt som kalles modifisering krysstale fem. På grunn av den samlede symmetrisk arkitektur av nucleosome, ble modifikasjons reaksjoner og crosstalk mekanismer tenkt å skje på samme måte på de to eksemplarer av hver nukleosomale histone (søster histoner). Dette konseptet ble nylig utfordret og senere avkreftet. Spesielt in vitro enzymatiske analyser for fri histon H3 hale peptider og på nukleosomer vist at et sett av H3-kinaser innført fosforylering på en asymmetrisk måte seks. I tillegg affinitets-rensing basert på LC-MS / MS-analyse avslørte eksistensen av asymmetrisk H3-metylert nukleosomer i flere typer eukaryote celler 7. Dermed asymmetrisk modifiserte nukleosomer utgjør nye arter, ogverktøy er nødvendig for å avdekke mekanismene som styrer deres dannelse og for å analysere crosstalk effekter som denne asymmetrien kan utøve. Vanligvis, Western blotting (WB) og massespektrometri (MS) -analyse er blitt anvendt for å detektere histon PTMs. Til tross for sin enkel applikasjon, lider WB fra spesifisitet / kryss-reaktivitet problemer. På toppen av det, er det ute av stand til å utføre samtidige multi-PTM analyse og direkte kvantifisering av modifikasjons reaksjoner 8. På den annen side, benytter MS-analyse avanserte instrumenter som krever høyt nivå trening, men gir høy spesifisitet, så vel som samtidig kartlegging og kvantifisering av flere PTMs 9. &#160; Men begge metoder er forstyrrende, og de nukleosomale kompleksene blir dissosiert før analysen, som gir opphav til en blanding av histoner og / eller histon-avledede peptider. Denne manipulasjon fjerner evnen til å skille uavhengigmodifikasjonsreaksjoner som forekommer på hver av de to søster histoner og for å rapportere kopierings-spesifikk modifisering status for nukleosomale histoner. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi utviklet seg som en alternativ metode for å kartlegge PTM reaksjoner. NMR er uavbrutt og således muliggjør overvåking av PTM begivenheter i sanntid måte rekonstituert blandinger, og selv i intakte celler 10, 11. Utviklingen av rutiner for hurtig datainnsamling og for høy oppløsning kartlegging basert på 2D-hetero-atomkorrelasjonsmetoder av isotop-merket (15 N og / eller 13 C) prøver 12 tillot samtidig kartlegging av forskjellige typer PTMs, f.eks som serin / treonin / tyrosinfosforylering, lysin acetylering / metylering, og arginin metylering 13. Avhengig av den PTM som undersøkes, 15 N- eller 13 C-merking protocols kan anvendes for å merke proteinet funksjonell gruppe som tjener som en modifikasjon reporter. Følgelig kan PTM kartlegging kan utføres ved å følge den karakteristiske kjemiske forskyvning forskyvning av den tilsvarende funksjonell gruppe &quot;avføle&quot; forandringen av den kjemiske miljøet. I de fleste tilfeller kan både NH og CH kjemiske grupper anvendes for å rapportere utviklingen av PTM av interesse. Den nåværende protokollen beskriver generasjonen av nukleosomer inneholder differensielt isotop-merkede søster histoner. Den kombinerer fleksibiliteten til NMR-spektroskopi for å kartlegge PTMs ved anvendelse av både 1 H 15 N og en H-13 C-korrelasjonsspektra med utnyttelse av forskjellige protein affinitet koder for rensning av de valgte rekonstituert histon komplekser. Spesielt protokollen benytter to ulike bassenger av en bestemt histone for nucleosome tilberedning. Disse bassengene er forskjellig isotop-merket (ett med <sup&gt; 15 N, den andre med 13 C), og de er fusjonert til et polyhistidin og et streptavidin affinitetsmerkelapp, respektivt. En tandem affinitet rensing ordningen med Ni-NTA og streptavidin-basert kromatografi opprinnelig brukt av Voigt et al. 7 anvendes for å rense asymmetrisk arter fra symmetriske motparter (figur 1A). Asymmetriske histone octamers brukes senere til rekonstituere tilsvar nukleosomale komplekser (Figur 1b), ved hjelp av standard salt dialysemetode 14. I tillegg, gjennom den samme prosedyre og ved å ha en av de histon bassengene pre-modifisert, en PTM kan inkorporeres asymmetrisk på de resulterende nucleosomes. Reaksjonen av disse substrater med histon-modifiserende enzymer og etterfølgende NMR-avbildning av modifikasjons arrangementer som gir den karakteriseringen av krysstale mekanismer både i-cis (premodified histon kopi) og i-trans (unmodified histon kopi) (figur 1C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Unfolding Buffer</td>
			<td>7M guanidinium HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refolding Buffer</td>
			<td>10mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>25mM NaxHxPO4 pH6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium HCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A14199</td>
			<td>Use high quality Gu-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1034557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1207-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-probe antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-tactin conjugated HRP</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1502-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Load 16/600 Superdex 200pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 1, 132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 7, 132129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution-state NMR spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

Asymmetrisk modifiserte nukleosomer inneholder to kopier av en histone (søster histoner) dekorert med forskjellige sett med posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs). De er nylig identifiserte arter med ukjent hjelp av etablering og funksjonelle implikasjoner. Nåværende analytiske metoder er utilstrekkelige for å oppdage kopien spesifikke forekomsten av PTMs på nukleosomale søster histoner. Denne protokollen gir en biokjemisk fremgangsmåte for in vitro rekonstituering av nukleosomer inneholdende differensielt isotopmerkede søster histoner. Den genererte komplekset kan også være asymmetrisk endret, etter blant annet en premodified histone bassenget under refolding av histone subcomplexes. Disse asymmetriske nucleosome preparater kan være lett omsettes med histon-modifiserende enzymer for å studere modifikasjonskrysstale mekanismer som pålegges av asymmetrisk forhånds innlemmet PTM ved hjelp av kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Spesielt, de modifikasjonsreaksjoner hossanntid kan kartlegges uavhengig på de to søster histoner ved å utføre ulike typer av NMR korrelasjons eksperimenter, skreddersydd for de respektive isotopen type. Denne metoden gir mulighet til å studere krysstale mekanismer som bidrar til dannelsen og utbredelsen av asymmetriske PTM mønstre på nukleosomale komplekser.

Riktig refoldede octameric arter er isolert etter en kjøre av tilberedning blandingen gjennom en gelfiltreringskolonne (figur 2). Det rekonstituerte octameric basseng inneholdende de tre forskjellige typer av octamers underkastes den tandem affinitetsrensing ordningen. Prøver samles fra alle trinnene og analysert ved hjelp av SDS-PAGE og deretter WB. Verifisering av den korrekte utførelse av den protokoll som resulterer i isolering av asymmetriske art oppnås ved å f...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Denne protokollen beskriver tilberedning av nukleosomer inneholder differensielt isotop-merkede søster histoner. På samme tid, kan asymmetrisk post-translasjonelt modifisert nukleosomer bli generert etter bruk av en premodified histon kopi. Disse preparatene kan lett brukes til å studere modifikasjon krysstalemekanismer, samtidig på begge søster histoner, ved hjelp av høy-oppløsning NMR-spektroskopi.

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Å avgjøre hvis DNA farget med en Cyanine Dye kan bli fordøyd med begrensning enzymer

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Borstemmaskin immobilisert metall affinitet Ture, rekonstituering og analysen av en Polyhistidine merket Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...