Name: reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Författaren tackar Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) för att ge våt-lab utrymme och infrastruktur för att utföra experiment och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) för att finansiera arbetet genom ett forskningsbidrag (LI 2402 / 2-1).

1. Beredning av Nukleosomer med Differentiellt Isotopmärkt (och asymmetriskt Ändrad) Sister Histoner OBS: Den nuvarande protokollet beskriver beredning av nukleosomer med differentiellt isotopmärkt histon H3. För detta ändamål har två pooler av histon H3 används; en var 15 N-märkt och innehöll en 6xHis-tag vid N-terminalen och den andra var 13 C-märkt och innehöll Strep peptiden (WSHPQFEK) smält vid N-terminalen. Båda taggar separerades från den nati...

<ol>
	<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution:+Determinants,+Mechanisms,+and+Functions.">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes.">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications.">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Language+of+Histone+Crosstalk.">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events.">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li><li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetrically+Modified+Nucleosomes.">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications.">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection,+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy.">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li><li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+&#945;-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites.">Intracellular repair of oxidation-damaged &#945;-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251 (2016).</li><li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds.">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling,+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy.">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA.">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy+:SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li><li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy.">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li><li>St&#252;tzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails.">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li><li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+K16Q+Mutation,+an+Acetylation+Mimic,+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome.">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts.">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins.">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy.">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li><li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes.">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li></ol>

För nukleosomen beredning utnyttjar det nuvarande protokollet en 165 bp lång DNA-mall innehållande 601-Widom nukleosomen positioneringssekvens 20, men liknande resultat förväntas med hjälp av olika längder av DNA-mallar. Protokollet designades och anställda som använder asymmetriska typer av histon H3. Med samma princip kan metoden tillämpas även för de övriga kärnhistonerna och dessutom kan användas för att rekonstruera komplex som har två distinkta kärnhistonerna med olika iso...

Eukaryot DNA är tätt förpackad i cellkärnor i kromatin. Den grundläggande byggstenen i kromatin är nukleosomen kärnpartikeln som innehåller ~ 147 bp DNA virad runt en octameric komplex består av två exemplar vardera av de fyra kärnhistonerna (H3, H4, H2A, H2B). Histonproteiner hyser en uppsjö av posttranslationella modifikationer (PTMs). Dessa kovalenta substitutioner medföra förändringar i kromatinstrukturen, både direkt genom att påverka fysikalisk kemi i systemet och indirekt genom att rekrytera kromatin-remodeling aktiviteter 1, 2, 3. Genom dessa medel, histon PTMs kontrollera kromatin tillgänglighet och därmed reglera alla DNA-baserade cellulära funktioner 4. PTMs installeras av histon-modifierande enzymsystem i huvudsak på de ostrukturerade N-terminala segment (svansar) av nukleosomen införlivade kärn histones. På grund av de många modifieringsställen på relativt kort sekvens av histon svansar, PTMs påverkar varandra genom att inducera eller blockera efterföljande modifieringsreaktioner, en effekt som kallas modifiering överhörning 5. På grund av den totala symmetriska arkitektur nukleosomen var modifieringsreaktioner och överhörningsmekanismer tros ske på samma sätt på de två kopior av varje nukleosomal histon (syster histoner). Detta koncept har nyligen utmanade och därefter motbevisas. Särskilt in vitro enzymatiska analyser om fri histon H3 svans peptider och på nukleosomer visade att en uppsättning av H3 kinaser infört fosforylering på ett asymmetriskt sätt 6. Dessutom avslöjade affinitetsrening baserad LC-MS / MS-analys förekomsten av asymmetriskt H3-metylerade nukleosomer i flera typer av eukaryota celler 7. Således, asymmetriskt modifierade nukleosomer utgör nya arter, ochverktyg behövs för att avslöja de mekanismer som styr deras bildning och analysera överhörning effekter som denna asymmetri kan utöva. Vanligen, Western Blotting (WB) och masspektrometri (MS) -analys har använts för att detektera histon PTMs. Trots sin enkel applicering, WB lider specificitet / Korsreaktivitet problem. Ovanpå det, är den oförmögen att utföra samtidig multi-PTM analys och direkt kvantifiering av modifieringsreaktioner 8. Å andra sidan, använder MS-analys sofistikerad instrumentering som kräver hög nivå utbildning, men ger hög specificitet såväl som samtidig kartläggning och kvantifiering av multipla PTMs 9. &#160; Dock båda metoderna är störande och de nukleosomala komplexen dissocieras före analys, vilket ger upphov till en blandning av histoner och / eller histon-härledda peptider. Denna manipulation tar bort förmågan att särskilja oberoendemodifieringsreaktioner som inträffar på var och en av de två syster histoner och rapportera kopian specifika modifiering status nukleosomala histoner. Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi utvecklats som en alternativ metod för att kartlägga PTM reaktioner. NMR är nondisruptive och sålunda tillåter övervakning av PTM evenemang i en realtids sätt på rekonstituerade blandningar, och även i intakta celler 10, 11. Utvecklingen av rutiner för snabb datainsamling såväl som för hög upplösning kartläggning baserad på 2D heteronukleära korrelationsmetoder för isotopmärkta (15 N och / eller 13 C) prover 12 tillät samtidig kartläggning av olika typer av PTMs, såsom som serin / treonin / tyrosinfosforylering, lysin acetylering / metylering, och arginin metylering 13. Beroende på PTM under utredning, 15 N- eller 13 C-märkning protocols kan användas för att markera det protein funktionell grupp som tjänar som en modifikation reporter. Följaktligen kan PTM kartläggning utföras genom att följa den karakteristiska kemiska skift förskjutning av motsvarande funktionella gruppen &quot;avkänning&quot; förändringen på den kemiska miljön. I de flesta fall kan både NH och CH kemiska grupper användas för att rapportera utvecklingen av PTM av intresse. Den nuvarande protokollet beskriver genereringen av nukleosomer innehållande differentiellt isotopmärkta syster histoner. Den kombinerar flexibiliteten hos NMR-spektroskopi för att kart PTMs med användning av både en H- 15 N och 1 H- 13 C-korrelationsspektra med användning av olika proteinaffinitetsmarkörer för rening av de utvalda rekonstituerade histonkomplex. Noterbart använder protokollet två olika pooler av en viss histon för nukleosomen beredning. Dessa pooler är differentiellt isotopmärkt (ett med <sup&gt; 15 N, den andra med 13 C), och de är sammansmälta med en polyhistidin och ett streptavidin affinitetsmärkning, respektive. En tandem affinitet system med Ni-NTA och streptavidin-baserad kromatografi rening användes ursprungligen av Voigt et al. 7 används för att rena asymmetrisk arter från symmetriska motsvarigheter (Figur 1A). Asymmetriska histon oktamerer används därefter för att återskapa motsvarande nukleosomala komplex (Figur 1B) med hjälp av standardsaltdialysmetod 14. Dessutom, genom samma förfarande och genom att ha en av de histon pooler pre-modifierad, en PTM kan införlivas asymmetriskt på de resulterande nukleosomer. Reaktionen av dessa substrat med histonmodifierande enzym och efterföljande NMR-kartläggning av modifierings händelser gör det möjligt för karakterisering av överhörningsmekanismer både i cis (premodified histon kopia) och in-trans (unmodified histon kopia) (Figur 1C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Unfolding Buffer</td>
			<td>7M guanidinium HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refolding Buffer</td>
			<td>10mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>25mM NaxHxPO4 pH6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium HCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A14199</td>
			<td>Use high quality Gu-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1034557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1207-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-probe antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-tactin conjugated HRP</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1502-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Load 16/600 Superdex 200pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 1, 132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 7, 132129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution-state NMR spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

Asymmetriskt modifierade nukleosomer innehåller två kopior av en histon (syster histoner) dekorerad med distinkta uppsättningar av posttranslationella modifikationer (PTMs). De nyligen identifierade arter med okända medel för etablering och funktionella konsekvenser. Aktuella analysmetoder är otillräckliga för att detektera kopian specifika förekomsten av PTMs på nukleosomala syster histoner. Detta protokoll utgör en biokemisk metod för beredning av nukleosomer innehållande differentiellt isotopmärkta syster histoner in vitro. Den genererade komplexa kan också vara asymmetriskt modifieras efter bland annat en premodified histon pool under återvikning av histon subcomplexes. Dessa asymmetriska nukleosomen beredningar kan lätt bringas att reagera med histonmodifierande enzym att studera modifierings överhöringsmätare mekanismer som åläggs av asymmetriskt förväg införlivad PTM med användning av kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Bestämt är modifieringsreaktioner irealtid kan mappas självständigt på de två syster histoner genom att utföra olika typer av NMR-korrelationsexperiment, skräddarsydda för respektive isotop typ. Denna metod ger möjlighet att studera överhörning mekanismer som bidrar till bildandet och utbredningen av asymmetriska PTM mönster på nukleosomala komplex.

Korrekt återveckade octameric arter isoleras efter en körning av beredning blandningen genom en gelfiltreringskolonn (Figur 2). Den färdigberedda octameric pool som innehåller tre olika typer av oktamerer utsätts för tandem affinitetsreningsschemat. Prover samlas från alla steg och analyserades genom SDS-PAGE och därefter WB. Kontroll av korrekt genomförande av protokollet som resulterar i isolering av asymmetriska arter uppnås genom att följa närvaron av de ...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Detta protokoll beskriver beredning av nukleosomer innehållande differentiellt isotopmärkta syster histoner. Samtidigt, kan asymmetriskt posttranslation modifierade nukleosomer genereras efter att ha använt en premodified histon kopia. Dessa preparat kan lätt användas för att studera modifieringen hörningsmekanismer, samtidigt på båda syster histoner, genom användning av högupplösande NMR-spektroskopi.

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Att avgöra om DNA färgas med en cyanin färgämne kan smältas med restriktionsenzym

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi, beredning och analys av en Polyhistidine Taggad Metalloenzyme för grundutbildning laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...