Name: organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells
Uploaded: 2017-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells at JoVE.com

De auteurs bedank Christine Auste voor haar steun met de video-opname en Chalid Ghadban voor zijn uitstekende technische hulp. Urszula Grabiec werd gesteund door de Roux Programm FKZ 29/18/EG.

dier experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig het beleid van ethiek en het beleid inzake het gebruik van dieren in het onderzoek neurowetenschap zoals goedgekeurd door de Europese Gemeenschappen Raad richtlijn 2010/63/EG van het EuropeesParlement en de Raad van de Europese Unie betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden.
 1. voorbereiding van de instrumenten en cultuurmedia <ol><li>voor bereiding van OHSC de volgende set van instrumenten gebruiken: twee...

Dit protocol beschrijft de bereiding van OHSC. Dit model kunnen testen van intrinsieke mogelijkheden en reacties van hersenweefsel na de toepassing van fysiologische en pathologische stimuli. Naast analyses van elektrofysiologische parameters, kan OHSC lesioned en de gevolgen van schade voor alle celtypes kunnen worden bepaald. Behandeling met verschillende stoffen en de gedetailleerde beschrijving van lesioning processen of genezing in de afwezigheid van macrofagen en lymfocyten is mogelijk.
...

OHSC zijn een goed gekarakteriseerd in vitro model om te studeren zowel fysiologische en pathologische eigenschappen van neuronen, astrocyten en microglia1. Het is gemakkelijk om te controleren de extracellulaire omgeving en controleren van de cellulaire en morfologische veranderingen na verschillende prikkels. De organisatie van de hippocampal neuronen en hun verbindingen zijn goed bewaard gebleven na voorbereiding2,3. Uit verschillende voordelen, OHSC toestaan controle van hersenen letsel en tumor invasie zonder dierlijke chirurgie. Zes tot acht OHSC kan worden verkregen van een enkele knaagdier hersenen. OHSC helpen daarom aanzienlijk verminderen van het aantal dieren en laten testen van meerdere drugs concentraties, genetische manipulaties of laesie van de verschillende modellen in hetzelfde dier. In segment gebaseerde testen, experimentele omstandigheden precies controleerbaar. Bovendien tijdsafhankelijke ontwikkelingsprocessen van pathologische condities als secundaire schade door time-lapse imaging gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd.
In het gegeven protocol, oorspronkelijk opgericht door Stoppini et al. 4, de voorbereiding stappen worden beschreven en belangrijke morfologische bezienswaardigheden voor de selectie van passende segmenten worden gemarkeerd. Het is raadzaam de voorbereiding van postnatale dag 7-9 ratten of muizen postnatale dag 4-5. In deze periodes Toon OHSC een robuuste weerstand tegen mechanische trauma's en een hoog potentieel voor reorganisatie van neuronale circuits. Daarentegen preparaten van embryonaal of volwassen ratten snel veranderen hun structuur en hun organotypic morfologie verliezen tijdens de teelt en zijn daarom minder geschikt voor de studie van langdurige processen in fundamenteel onderzoek5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. een ander kritisch punt voor de overlevingskansen van OHSC is de dikte van het segment zelf als de verspreiding en dus voedingsstoffen levering beperkte12,13,14 zijn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:412px;">6-Well</td>
			<td style="width:204px;">Falcon</td>
			<td style="width:179px;">35-3046</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclav</td>
			<td>Systec</td>
			<td>DX-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CFDA</td>
			<td>&#160;Thermo Fisher</td>
			<td>V12883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eagle&#180;s Minimal Essential Medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>32360-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein labeled GSL I &#8211; isolectin B4</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FL-1201&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Merk</td>
			<td>1083371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hank&#180;s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hank&#180;s Balanced Salt Solution (without Ca2+&#160; and Mg2+)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LN229</td>
			<td>Cell-Lines-Service</td>
			<td>300363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Millicell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NMDA N-methyl-D-aspartic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal Horse Seum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes (all sizes)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>627160/664160/628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PFA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0335.1</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodid (PI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>81845-25MG</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">U138</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica VT 1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic hippocampal slice cultures as a model to study neuroprotection and invasiveness of tumor cells

In organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) zijn de morfologische en functionele kenmerken van zowel zenuwcellen en gliacellen goed bewaard. Dit model is geschikt voor het aanpakken van verschillende onderzoeksvragen die betrekking hebben op onderzoek naar neuroprotectie, elektrofysiologische experimenten op neuronen, neuronale netwerken of tumor invasie. De hippocampal architectuur en neuronale activiteit in multisynaptic circuits zijn goed bewaard in OHSC, hoewel de segmenteringshulplijnen procedure zelf in eerste instantie laesies en leidt tot de vorming van een gliale litteken. De littekenvorming verandert vermoedelijk de mechanische eigenschappen en diffusive gedrag van kleine molecules, enz. Segmenten kunnen nagaan van tijd-afhankelijke processen na hersenletsel zonder dierlijke chirurgie, en studies over de interacties tussen de verschillende soorten van de hersenen-afgeleide cellen, namelijk astrocyten, microglia en neuronen onder zowel fysiologische en pathologische voorwaarden. Een ambivalente aspect van dit model is het ontbreken van de bloedstroom en bloed immuuncellen. Tijdens de progressie van de neuronale schade, migreren immuuncellen uit het bloed spelen een belangrijke rol. Als deze cellen in plakjes ontbreken, kunnen de intrinsieke processen in de cultuur worden waargenomen zonder buitenlandse inmenging. Bovendien, in OHSC wordt de samenstelling van het medium-externe milieu precies geregeld. Een ander voordeel van deze methode is het lagere aantal geofferde dieren in vergelijking met standaard preparaten. Verschillende OHSC kan worden verkregen van het ene dier gelijktijdige studies met meerdere behandelingen in één dier mogelijk te maken. Om deze redenen, OHSC zijn zeer geschikt voor het analyseren van de gevolgen van nieuwe beschermende therapeutics na weefselbeschadiging of tijdens de invasie van de tumor.
Het protocol gepresenteerd hier beschrijft een methode van de voorbereiding van OHSC waarmee genereren zeer reproduceerbaar, goed bewaard gebleven segmenten die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van experimenteel onderzoek, zoals neuroprotectie of tumor invasie studies.

Neuroprotectie studies: Om te bepalen van neuronale schade, het aantal PI positieve kernen en IB4 positieve microglia in elke derde optische sectie van de cellaag van de submodule (GCL) voor de getand gyrus (DG) werd geteld. Voor tumor invasie experimenten, werd de maximale intensiteit z-projectie van de stack gebruikt voor de berekening van het verdragsgebied van tumorcellen, als een maatregel van de invasie en visualiseren van verschillende invasie patronen (...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells at JoVE.com

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypische hippocampus Slice culturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...