Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

ونحن نعترف أوستن Cyphersmith وMayandi Sivaguru (كارل معهد ر Woese للبيولوجيا الجينوم في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين) للحصول على المساعدة مع المجهر ولاستيعاب بسخاء الشاشة والتقاط الفيديو في صميم المجهر.

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

في تجاربنا، وجدنا أن الفشل الأكثر شيوعا ترتبط نوعية صفائف ملفقة وسيئة اتسمت استجابة في النظام البيولوجي للاهتمام. نشير للقارئ أن الجدول رقم 1 لعدم وسائط مشتركة في تجارب الخلايا ميكروأري وما يرتبط بها من خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. فيما يتعلق بنوعية صفائف على وجه الخصوص، ونحن نوصي بما يلي: تأكيد الجودة التقنية ومتانة تنظيم البرامج والمعلمات، والمخازن باستخدام جزيئات fluorescently المسمى مثل ديكستران-رودامين مترافق. دبابيس نظيفة تماما سواء قبل أو بعد تنظيم فقا لتعليمات الشركة الصانعة وزيادة بصريا الاختيار أن القنوات دبوس واضحة من الحطام باستخدام المجهر الضوئي. تأكيد الاحتفاظ جزيء حيوي العريض باستخدام البقع بروتين العامة أو immunolabeling. لاحظ أن الجزيئات الحيوية مع الوزن الجزيئي أقل من 70 كيلو دالتون كثيرا ما لا يتم الاحتفاظ في هيدروجيل 23، </<html> سوب&gt; 31. التحقق من صحة العريض جزيء حيوي خلية وظيفة باستخدام أنواع خلايا متعددة. لاحظ أن الخلايا الملتصقة فقط متوافقة مع المصفوفات. بالإضافة إلى ذلك، الانضمام إلى صفوف يعتمد على كل من خصائص خلية معينة (على سبيل المثال، إنتغرين الشخصي التعبير) والبروتينات ECM المحدد. نظرا لضيق المساحة، ونحن لم تقدم علاجا واسعة من تصميم مجموعة، والتخطيط، وتلفيق هنا وتحيل القارئ إلى سابقة يعمل 23 و 25. ونحن عموما استخدام 100 subarrays بقعة (150 قطرها ميكرون بقعة، 450 ميكرون المسافة مركز إلى مركز) تتألف من 10-20 الظروف جزيء حيوي فريد (أي 5-10 البقع / حالة). عدد subarrays في مجموعة واحدة تختلف تبعا لعدد من الشروط جزيء حيوي من الفائدة، والتي يمكن زيادتها بشكل مريح حتى 1280 على واحد 25 × 75 مم شريحة المجهر (~ 6400 البقع في 64 subarrays)XREF &quot;&gt; 25، 31 المعلمات أعلاه إلى أن تختلف تبعا لحجم نمط من الفائدة؛ دبابيس قادرة على توليد أنماط من 75 - متوفرة بسهولة 450 ميكرون. من الأفضل أن تستكمل التجارب مجموعة من التحقق من شروط عالية التهديف المحتشدة الاهتمام باستخدام صيغ ثقافة أخرى، قراءات الفحص، ونظم نموذج البيولوجية. على وجه التحديد، ونحن نوصي مزيد من التحقق من آثار الظروف المحتشدة مختارة باستخدام الثقافات السائبة بالتزامن مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية (على سبيل المثال، QRT-PCR، immunoblotting) أو الآلية المالية المؤقتة القياسية. التلاعب الجيني (على سبيل المثال، ضربة قاضية أو overexpression) من العوامل ذات الأهمية في النظام النموذجي البيولوجي المناسب يمكن أن تخدم أيضا لتأكيد الآثار الملاحظة في المصفوفات. في الجسم الحي وتمثل النماذج الحيوانية وسيلة أخرى لإثبات واستخدمت في الآونة الأخيرة، على سبيل المثال، للتأكيد على الدور المركزي للgalectin-3 و galectin-8 فيسرطان الرئة المنتشر المتخصصة، كما حددت في البداية عن طريق خلية ميكروأري 31، 49. وقد تم استخدام عدد من الأساليب الأخرى لتحقيق التنظيم microenvironmental من الوظائف الخلوية، بما في ذلك مجموعة متنوعة من اثنين الأبعاد أنظمة microfabricated 18، 50، 51، 52، 53، 54، 55 و ثلاثية الأبعاد أنظمة بيولوجية المهندسة 56، 57، 58 ، 59، 60، 61. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، ومزايا معينة من منصة الخلية ميكروأري هو موضح هنا تتكون من: (1) إنتاجية تصل إلىمئات أو آلاف من مجموعات مختلفة من العوامل، مما يتيح تحليل آثار التفاعل. (2) يمكن الوصول إليها، والتصوير والتحليل الآلي. (3) دمج هاتين قراءات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية مع عرض رقابة من العوامل المحتشدة. (4) القدرة على تغيير خصائص المواد الركيزة. و (5) تحليل وحيدة الخلية عالية المحتوى من مصير الخلايا وظيفة. وباختصار، فإن الجمع بين المجهرية الخلية مع الآلية المالية المؤقتة على ركائز من صلابة الركيزة الانضباطي يمكن توصيف دقيق لكل من الاشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية. كما وردت هنا، هذه المنصة هي للتعميم ويمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الملتصقة والسياقات الأنسجة نحو فهم أفضل لتنظيم microenvironmental اندماجي من تمايز الخلايا وmechanotransduction.

التفاعلات بين الخلايا والمحيطة العوامل microenvironmental تتوسط مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية في جميع أنحاء التنمية، التوازن، والتسبب 1، 2، 3، 4 المرض. وتشمل هذه التفاعلات microenvironmental تسليم من العوامل القابلة للذوبان إلى الخلايا، خلية مصفوفة ملزمة، والتفاعلات خلية خلية عبر يجند مستقبلات ملزمة. وبالإضافة إلى الاعتبارات الحيوية المذكورة أعلاه، المعلمات الفيزيائية الحيوية، مثل الخصائص الميكانيكية الركيزة (على سبيل المثال، معامل يونغ، المسامية) وشكل الخلية، وما يرتبط بها من mechanotransduction المصب اكتسبت على نحو متزايد الاعتراف بها الوسطاء الرئيسيين من تمايز الخلايا 5، 6، 7، 8، 9 <sup&gt; 10. الإشارات الناتجة من هذه التفاعلات microenvironmental بمثابة مدخلات لشبكات الجينات ومسارات إشارات. وعلاوة على ذلك، كما توفر هذه المكونات خلايا ذاتية التغذية الراجعة للالمكروية عبر العوامل يفرز والانزيمات المهينة المصفوفة، واستكمال حلقة معقدة شارك التنظيمي بين البرامج الجينية الخلايا الذاتية والعوامل خلية خارجي microenvironmental 5 و 11 و 12. وقد ثبت أن استخدام نظم هندسيا لعرض رقابة من العوامل microenvironmental مفيدا في مجموعة من السياقات المختلفة 13 و 14 و 15. وقد سهلت أنظمة Microfabricated على وجه الخصوص الزخرفة المكانية دقيقة من البروتينات والخلايا وكذلك تحليل بشكل متوازي للغاية عبر التصغير 13، <supالطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22. تمثل ميكروأرس خلية واحدة مثل هذا النظام microfabricated التي مجموعات من الجزيئات الحيوية هي من الاتصال المطبوعة على وهيدروجيل الركيزة بولي أكريلاميد مرن 23، 24، 25. إدراج عناصر خلية لاصقة (وهي البروتينات المصفوفة) تمكن التصاق مستمر الخلية والثقافة على القطع الصغيرة، التي كثيرا ما يتبعه تحليل المصب عبر مناعية وصحفيين الفلورسنت. وجهت ميكروأرس خلية منتجة نحو تحقيق تحسين فهم خلية الكبد النمط الظاهري 23، 26، العصبية السلائف التمايز 27، معمر الذي كان ينتظرقرارات ذ السلف مصير 28، الجنينية الخلايا الجذعية صيانة / التمايز 23، 29، 30، سرطان الرئة ورم خبيث 31، والاستجابة العلاجية في سرطان الجلد 32. لقد أثبتت مؤخرا استخدام ميكروأرس الخليوي لتحديد دور المصفوفة خارج الخلية (ECM) تكوين البروتين في مواصفات الأديم 33، الكبد السلف التمايز 34 و 35، وورم الرئة استجابة الخلية المخدرات 36. في هذه الأعمال، فقد ركزنا على توسيع قدرات اندماجي من منصة مجموعة واستكشاف تقاطعات إشارات الخلية الجوهرية مع تكوين مصفوفة خارج الخلية والميكانيكا الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بتنفيذ قراءات الفيزيائية الحيوية في هذه المنصة مجموعة لتوفير القدرة على كميا characterize دور انقباض الخلايا في التمايز عمليات 35. للقيام بذلك، ونحن متكاملة المجهري قوة الجر (TFM) مع ميكروأرس خلية لتمكين تقييم الإنتاجية العالية من الجر ولدت الخلية. الآلية المالية المؤقتة هي طريقة تستخدم على نطاق واسع لقياس قوى الجر ولدت الخلية، وقدمت أفكارا هامة بشأن تنسيق وحيدة الخلية وظيفة على مستوى الأنسجة لتكوين والميكانيكا الحيوية من المكروية المحلية 37، 38، 39، 40. وهكذا، والجمع بين الآلية المالية المؤقتة مع ميكروأرس خلية يوفر نظام الإنتاجية العالية لقياس الرئيسية، المعلمات الفيزيائية الحيوية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. منصة الخلية ميكروأري هو موضح هنا تتكون من أربعة أقسام: تلفيق ركائز بولي أكريلاميد، تصنيع المصفوفات، زراعة الخلايا وقراءات الفحص، وتحليل البيانات. نرىالشكل رقم 1 لملخص تخطيطي لثلاثة أقسام التجريبية الأولى. انظر الشكل 2 للحصول على ملخص تخطيطي من القسم الأخير مع التركيز على تحليل البيانات المناعي. من أجل التكيف مع منصة الخلية ميكروأري لدراسات النشاط الحيوي التفاعلات خلية الركيزة، كنا ركائز بولي أكريلاميد معامل الانضباطي يونغ لكن المسامية مماثلة، في ون وآخرون. 41. لتمكين القياسات الآلية المالية المؤقتة من قوات من الخلايا على الركيزة التي تمارسها، نفذنا بيتري شكل صحن زجاج القاع بالإضافة إلى المجهر الزجاج السميك في كثير من الأحيان الشرائح التي تستخدمها الجماعات الأخرى. وهكذا، هذه المنصة الخلية ميكروأري قادرة على قياسات موازية للتمايز الخلايا عن طريق المناعي على الشرائح المجهر والقوى المولدة الخليوي عبر الآلية المالية المؤقتة على أطباق الزجاج السفلي منفصلة. لقد طبقنا أيضا العديد من التحسينات على النهج التحليلي يشيع استخدامها مع المجهرية الخلية. Specificalلاي، بدلا من حدودي Z-التهديف من شدة جزيرة الشاملة، نقيس كثافة وحيدة الخلية وتطبيق التطبيع quantile في ذلك لحساب التوزيعات غير العادية وأكثر دقة وصف السلوك الخلوي. ونعتقد أن هذه التحسينات توفر فائدة معينة تجاه التحقيقات في العمليات البيولوجية التي العظة على حد سواء البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية تلعب كبيرة، والأدوار المتداخلة. وعلاوة على ذلك، وإدخال تحسينات تحليلية لدينا تتيح تطبيق المجهرية الخلية إلى دراسات لمجموعة من الوظائف الخلوية التي وحيدة الخلية والسلوك على مستوى السكان تتباعد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

ميكروأرس الخلوية Microfabricated، والتي تتكون من مجموعات مطبوعة الاتصال الجزيئات الحيوية على سطح هيدروجيل مرن، وتوفير رقابة مشددة، الإنتاجية العالية نظام هندسيا لقياس أثر الإشارات البيوكيميائية المحتشدة على تمايز الخلايا. وقد أثبتت الجهود التي بذلت مؤخرا باستخدام المجهرية الخلية فائدتها للدراسات اندماجي الذي يتم العديد من العوامل microenvironmental بشكل متواز. ومع ذلك، فقد ركزت هذه الجهود في المقام الأول على التحقيق في الآثار من الاشارات البيوكيميائية على استجابات الخلايا. هنا، نقدم منصة الخلية ميكروأري مع خصائص المواد الانضباطي لتقييم كلا تمايز الخلايا المناعي والنشاط الحيوي خلية الركيزة التفاعلات التي كتبها قوة الجر المجهري. للقيام بذلك، وقد وضعنا شكلين مختلفين باستخدام الهلاميات المائية بولي أكريلاميد متفاوتة معامل يونغ ملفقة على أي من شرائح المجهر أو أطباق بتري الزجاج السفلي. ونحن نقدم بيزالممارسات ر واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتصنيع القطع الصغيرة على هذه ركائز هيدروجيل، وزراعة الخلايا لاحقة على المجهرية، والحصول على البيانات. ومناسبة تماما هذا المنبر لاستخدامها في التحقيقات في العمليات البيولوجية التي على حد سواء والكيمياء الحيوية (على سبيل المثال، خارج الخلية تكوين مصفوفة) وفيزيائية (على سبيل المثال، الركيزة صلابة) العظة قد تلعب كبير، المتقاطعة الأدوار.

باستخدام هذه المنصة، ونحن التحقيق في دور كل من الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية في مواصفات مصير الأسلاف الكبد 34، 35. وأظهرت البروتين وبروابط / G-مترافق الشق تحسين الاحتفاظ والتجميع في هيدروجيل بولي أكريلاميد (الشكل 3A) وكانت قادرة علاوة على القيادة التفريق بين الأسلاف الكبد نحو مصير خلية القناة الصفراوية (الشكل 3B). عن طريق تحليل وحيدة الخلية، ونحن كميا ردا على بروابط الشق للبروتينات ECM أنا الكولاجين، الكولاجين الثالث، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، و laminin (الشكل 3C)، وجدت أن رد فعل الأسلاف الكبد ليجند تعتمد أيضا على السياق ECM. وأخيرا، ونحن استخدام shRNA ضربة قاضية لتوليد الأسلاف الكبد دون بروابط DLL1 وJag1. وردا على يجند الشق المحتشدة يختلف طبقا لنوع العلاقات العامةesence إما يجند، مؤكدا أن الاستجابة ليجند خلية خارجي هو أيضا وظيفة من يجند التعبير عن خلية الجوهرية (الشكل 3D). وعلاوة على ذلك، لاحظنا جزء من السكان متميزة من ضعف إيجابية (ALB + / OPN +) الخلايا في ضربة قاضية DLL1 (الشكل 3D). معا، وتشير هذه النتائج التمثيلية: (1) قدرات اندماجي في شكل مجموعة، كما يتضح من الاقتران من مضاعفات المحتشدة البروتينات ECM وبروابط الشق مع ضربة قاضية للبروابط الفردية؛ (2) وظائف ليس فقط تناثرت البروتينات ECM ولكن أيضا تناثرت يجند خلية خلية عن طريق بروتين A / G اقتران بوساطة؛ و (3) تنفيذ تحليلنا وحيدة الخلية وقدرتها على تمييز مجموعات سكانية فرعية فريدة من نوعها. لاحظنا أيضا أن التفريق بين الأسلاف الكبد يعتمد على كل من صلابة الركيزة وتكوين ECM (الشكل 4A </str<html> أونج&gt;)، وإيجاد وجه التحديد أن الكولاجين الرابع هو داعم للتمايز على كل من ركائز لينة وصلبة في حين الفيبرونكتين يعتمد فقط التمايز على ركائز صلبة (الشكل 4B). وتشير خرائط الحرارة تمثيلية القياسات الآلية المالية المؤقتة أن الإجهاد الجر المستمر في انخفاض صلابة الركيزة الكولاجين الرابع تعزيز التمايز إلى خلايا القناة الصفراوية (الشكل 4C)، وهي نتيجة أكدتها متوسط جذر متوسط مربع القيم (الشكل 4D). معا، وتشير هذه النتائج التمثيلية: (1) الاندماج الناجح من نسبة المواد الدسمة مع المجهرية الخلية على ركائز مع صلابة الانضباطي لتقييم كل من النمط الظاهري الخلية والإجهاد الجر. (2) التنسيق بين مصير خلية سلفية الكبد مع كل من تكوين مصفوفة وصلابة الركيزة. و (3) تنفيذ دينا الآلية المالية المؤقتة تحليل ونموذجية ملامح الإجهاد الجر في المجهرية الخلية. <html> ه 1 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي عرض أول ثلاثة أقسام التجريبية. في القسم 1، يتم تنظيفها ركائز الزجاج وsilanized لتسهيل تصنيع الهلاميات المائية بولي أكريلاميد. في القسم 2، يتم إعداد تركيبات جزيء حيوي للمصلحة في صفيحة مصدر 384 أيضا. ثم يتم تحميل arrayer الروبوتية مع دبابيس نظيفة، وصفيحة المصدر، والهلاميات المائية بولي أكريلاميد وتهيئة وتصنيع المصفوفات على الهلاميات المائية. في القسم 3، هي المصنفة الخلايا على المجالات العريض والسماح للالالتزام، وبعد ذلك يتم تنفيذ بروتوكول ثقافة الفائدة. عند نقطة النهاية، إما أن تكون ثابتة خلايا مناعية ل/ المناعي أو تحليلها باستخدام الآلية المالية المؤقتة. الحانات هي مقياس 75 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> ضمن الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> الشكل 2: معالجة وتحليل البيانات المناعي من المصفوفات. (A) القرميد، واهمال المركبة صور RGB 32 بت أولا ثم تنقسم إلى قنوات 8 بت الفردية. باستخدام مزيج من علامات الفلورسنت المحتشدة والجزر خلية، يتم تحديد ثلاث زوايا للمجموعة للسماح للتوجيه الآلي وgridding من المصفوفات. تم إنشاؤه (ب) بيانات وحيدة الخلية لكل قناة من صفائف الإدخال. من أجل لحساب الانحراف تجريبي، يتم تطبيق التطبيع quantile من تكرار البيولوجي، مما ينتج عنه توزيع مشترك واحد في جميع مكررات. Quantile يتم رسم البيانات تطبيع في وقت لاحق وتفسيرها عن طريق حساب القياسات فرقة (على سبيل المثال، خلايا / الجزيرة، يعني كثافة الخلايا نسبة إيجابية للتسمية) أو التحليل المباشر للتوزيعات وحيدة الخلية.م / الملفات / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> الشكل (3): الشق يجند عرض تتوسط كبد السلف التمايز. (A) بروابط-FC المؤتلف الشق خشنة-1 (JAG1) ودلتا مثل 1 (DLL1) عرضت تحسين الاحتفاظ والتجميع عندما تصطف مع بروتين A / G. شريط النطاق هو 50 ميكرون. الأسلاف (ب) الكبد متباينة في خلايا القناة الصفراوية عند تقديم مع يجند الشق. 4 &quot;، 6 Diamidino-2-phenylindole (دابي) هو التسمية النووية، الزلال (ALB) هي علامة الخلية الكبدية، وosteopontin (OPN) هو علامة الصفراء خلية لاصق. شريط المقياس هو 150 ميكرون. (C) الكمي من النسبة المئوية للخلايا إيجابية لOPN لبروابط الشق JAG1، DLL1، ودلتا مثل 4 (DLL4) على البروتينات ECM الكولاجين الأول، جollagen الثالث، الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، و laminin. أجريت -tests ر الطالب ضد مفتش لمراقبة كل يجند الشق المحتشدة داخل كل بروتين ECM مع ف القيم المشار إليها لP &lt;0.05 (*). (D) التصوير الخلوي من ALB وOPN للخلايا الكولاجين في الثالث قدم مع بروابط الشق JAG1، DLL1، وDLL4. الأسلاف الكبد دون الشق بروابط DLL1 وJag1 (أي shDll1 وshJag1) تم إنشاؤها باستخدام shRNA ضربة قاضية. قدمت البيانات في (C) كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة وهذا الرقم قد تم تعديله من Kaylan وآخرون. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> الشكل 4: تكوين مصفوفة والركيزة تصلب سجعrdinate الكبد السلف التمايز. (A) الكبد السلف التمايز إلى خلايا الصفراء القناة تعتمد على كل من تكوين ECM وصلابة الركيزة. دابي هو تسمية النووية، ALB هو علامة الخلية الكبدية، وOPN هو علامة الصفراء خلية لاصق. (ب) الكمي من النسبة المئوية للخلايا إيجابية لOPN على ركائز من معامل يونغ 30 كيلو باسكال، 13 كيلو باسكال، و 4 كيلو باسكال لالكولاجين الأول (C1)، والكولاجين الرابع (C4)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وجميع اتجاهين مجموعات من تلك البروتينات ECM. (C) الإجهاد الجر الخلية يعتمد على كل من صلابة الركيزة وتكوين ECM. (D) الكمي للقيم جذر متوسط مربع من الإجهاد الجر على ركائز من معامل يونغ 30 كيلو باسكال و 4 كيلو باسكال لالكولاجين الأول (C1)، والكولاجين الرابع (C4)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وجميع اتجاهين مجموعات من تلك البروتينات ECM. في (ب) و (د)، قدمت البيانات كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة والطالب -tests رأجريت مقابل 30 كيلو باسكال لكل تركيبة ECM مع ف القيم المشار إليها لP &lt;0.05 (*)، P &lt;0.01 (**)، وP &lt;0.001 (***). الحانات هي مقياس 50 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من Kourouklis وآخرون. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> الجزء </td><td fo:width="1.5in"> مشكلة </td><td fo:width="1.5in"> الأسباب المحتملة </td><td> حل </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. تصنيع بولي أكريلاميد الركيزة. </td><td> ساترة لا يمكن إزالتها من هيدروجيل. </td><td> Overpolymerization. </td><td> تقليل وقت البلمرة إلى &lt;10 دقيقة (4 واط / م 2). تأكد من أن crossli الأشعة فوق البنفسجيةالناتج nker ضمن النطاق المتوقع. </td></tr><tr><td> الفقيرة بولي أكريلاميد هيدروجيل البلمرة. </td><td> Underpolymerization. </td><td> زيادة وقت البلمرة ل&gt; 10 دقيقة (4 واط / م 2). تأكد من أن الناتج الأشعة فوق البنفسجية crosslinker ضمن النطاق المتوقع. </td></tr><tr><td> معطوبة الهلاميات المائية بولي أكريلاميد بعد إزالة ساترة. </td><td> الهلاميات المائية بولي أكريلاميد لينة سهلة للتلف. </td><td> ونلاحظ تناقص الغلة هيدروجيل تلفيق (~ 50٪) لأنعم (أي 4 كيلو باسكال) الهلاميات المائية على وجه الخصوص. التعامل مع الهلاميات المائية بلطف وزيادة أعداد انطلاق لتحقيق العائد المطلوب. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. تصنيع صالحة. </td><td rowspan="2"> الفقراء أو تتعارض بقعة التشكل. </td><td> وظيفة المرطب غير متناسقة. </td><td> تأكد من أن المرطب ومقياس غلفاني وظيفية في جميع أنحاء كل النسخ المطبوعة والحفاظ على 65٪ RH. </td></tr><tr><td> دبابيس عالقة في رأس الطباعة أو تسدGED. </td><td> تنظيف رأس الطباعة للسماح للحركة دبوس الحرة. دبابيس نظيفة تماما قبل أو بعد كل النسخ المطبوعة لإزالة الركام من قنوات دبوس. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. خلية ثقافة والفحص تنفيذ. </td><td rowspan="2"> مفرزة الخلية أو الموت على المصفوفات بعد التعلق الأولي. </td><td> Overseeding والانتشار المفرط. </td><td> تقليل كثافة البذر الأولية والوقت. استخدام &quot;صيانة&quot; أو &quot;التمايز&quot; وسائل الاعلام خلال الثقافة مجموعة للحد من تكاثر الخلايا. </td></tr><tr><td> الافراج عن مونومر الأكريلاميد السامة من هيدروجيل. </td><td> نقع الهلاميات المائية في DH 2 O لا يقل عن 3 د للسماح للنشر / الافراج عن مونومر الأكريلاميد والحد من سمية الخلية. </td></tr><tr><td rowspan="4"> الخلايا لا نعلق على المصفوفات. </td><td> Underseeding. </td><td> زيادة كثافة البذر الأولية والوقت. استخدام أكثر تمسكا قويا نوع من الخلايا. </td></tr><tr><td> ترسب سوءمصفوفة أو حالة جزيء حيوي. </td><td> دبابيس نظيفة من الجسيمات والمجاميع، وتؤكد المعلمات الطباعة، وتقييم اكتشاف علامات الفلورسنت، على سبيل المثال،-رودامين مترافق ديكستران. </td></tr><tr><td> خصوصية التفاعلات خلية مصفوفة. </td><td> أنواع مختلفة من الخلايا تلتزم خصيصا لبعض وليس البروتينات ECM أخرى. اختبار عدة بروتينات ECM مختلفة مع الخلايا الخاصة بك. </td></tr><tr><td> تخزين مجموعة الأمثل بعد التصنيع. </td><td> نوصي تخزين المصفوفات ملفقة بين عشية وضحاها في 65٪ RH ودرجة حرارة الغرفة، في جزء منه لتجنب التغيرات مرحلة أثناء التجميد. التصاق الخلايا حساسة لكلا الرطوبة ودرجة الحرارة وفترة التخزين. تأكد من هذه المعايير متوافقة / الأمثل لتجاربك. </td></tr><tr><td rowspan="2"> مفرزة من هيدروجيل من الركيزة الزجاج خلال زراعة الخلايا. </td><td> تنظيف شريحة الفقراء وsilanization. </td><td> استبدال حلول العمل لتنظيف الشريحة وsilanization. </td></tr><tr><td> هيدروجيل Overdehydrated. </td><td> لا تترك الهلاميات المائية التجفيف على طبق ساخن لمدة أطول من 15-30 دقيقة. </td></tr><tr><td> 4. تحليل البيانات. </td><td> التباين الشديد بين المواقع تكرار والشرائح. </td><td> تقلب في تصنيع مجموعة. </td><td> تأكد من أن المسامير ورأس الطباعة نظيفة. تأكيد وظيفة المرطب. تصور وتحديد بقعة ومجموعة الجودة باستخدام علامات الفلورسنت. تخزين المصفوفات كما أوصت أعلاه. </td></tr></tbody></table> الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

وينظم تمايز الخلايا من قبل مجموعة من العوامل microenvironmental، بما في ذلك تكوين مصفوفة والمواد الركيزة خصائص. نحن هنا وصف تقنية استخدام ميكروأرس خلية بالتعاون مع قوة الجر المجهري لتقييم كلا تمايز الخلايا والنشاط الحيوي التفاعلات خلية الركيزة بوصفها وظيفة من السياق microenvironmental.

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...