Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Vi anerkender Austin Cyphersmith og Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institut for Genomic Biologi, University of Illinois i Urbana-Champaign) for at få hjælp med mikroskopi og for generøst imødekommende skærm og videooptagelse på mikroskopi kerne.

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

I vores eksperimenter har vi fundet, at de mest almindelige fejl er relateret til kvaliteten af ​​jern- arrays og dårligt karakteriseret respons i det biologiske system af interesse. Vi henviser læseren til tabel 1 for fælles svigt celle microarray eksperimenter og tilhørende fejlfindingstrin. Vedrørende kvaliteten af ​​arrays i særdeleshed, anbefaler vi følgende. Bekræft teknisk kvalitet og soliditet gruppere programmer, parametre og buffere hjælp fluorescensmærkede molekyler såsom rhodamin-konjugeret dextran. Grundigt rene stifter enten før eller efter at gruppere pr producentens anvisninger og yderligere visuelt kontrollere, at pin-kanaler er fri for snavs ved hjælp af et lysmikroskop. Bekræft array biomolekyle fastholdelse ved hjælp af generelle protein pletter eller immunolabeling. Bemærk, at biomolekyler med en molekylvægt under 70 kDa ofte ikke tilbageholdes i hydrogelen 23, </<html> sup&gt; 31. Validere array biomolekyle celle-funktionalitet ved hjælp af flere celletyper. Bemærk, at kun adhærente celler er forenelige med arrays; derudover, adhæsion til arrays er afhængig både celle-specifikke egenskaber (fx integrin ekspression profil) og de udvalgte ECM-proteiner. På grund af begrænset plads, har vi ikke givet en omfattende behandling af array design, layout og fabrikation her og henvise læseren til forrige værker 23, 25. Vi bruger generelt 100 spot subarrays (150 um spot diameter, 450 um center-til-center afstand) sammensat af 10-20 unikke biomolekylære betingelser (dvs. 5-10 pletter / tilstand). Antallet af subarrays i ét array varierer afhængigt af antallet af biomolekylære betingelser af interesse, som kan være komfortabelt opskaleres til 1.280 på en 25 x 75 mm mikroskopobjektglas (~ 6.400 pletter i 64 subarrays)xref &quot;&gt; 25, 31 Parametrene ovenfor vil yderligere variere afhængigt af mønstret størrelse af interesse;. pins stand til at generere mønstre på 75 - 450 um er let tilgængelige. Array eksperimenter er bedst suppleret med validering af høj scoring opstillede betingelser af interesse ved hjælp af andre kultur-formater, assay udlæsninger og biologiske modelsystemer. Konkret anbefaler vi yderligere validering effekter af udvalgte opstillede betingelser ved hjælp bulk-kulturer i forbindelse med standard molekylærbiologiske teknikker (f.eks QRT-PCR, immunoblotting) eller standard TFM. Genetisk manipulation (f.eks knockdown eller overekspression) af faktoren af interesse i et givet biologisk modelsystem kan også bekræfte, effekter observeret i arrays. In vivo dyremodeller repræsenterer et andet middel til validering og blev for nylig brugt, for eksempel til at bekræfte den centrale rolle, galectin-3 og galectin-8 ilungekræft metastatisk niche, som oprindeligt identificeret via celle microarray 31, 49. En række andre fremgangsmåder er blevet anvendt til at probe microenvironmental regulering af cellulære funktioner, herunder en række to-dimensionale mikrofabrikerede systemer 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 og de tredimensionelle manipulerede biomateriale systemer 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I sammenligning med andre metoder, de særlige fordele ved den celle microarray platform beskrevet her består af: (1) kapacitet Op tilhundredvis eller tusindvis af forskellige kombinationer af faktorer, der gør det muligt analyse af interaktion effekter; (2) tilgængelige, automatiseret billedbehandling og analyse; (3) integration af både biokemiske og biofysiske udlæsninger med kontrolleret præsentation af grupperede faktorer; (4) evne til at variere substrat materialeegenskaber; og (5) med højt indhold encellede analyse af celle skæbne og funktion. Sammenfattende kombinationen af ​​celle- microarrays med TFM på substrater af afstemmelig substrat stivhed muliggør grundig karakterisering af både biokemiske og biofysiske signaler. Som præsenteres her, denne platform er generaliseres og kan let anvendes til en række af adhærente celletyper og væv sammenhænge i retning af en bedre forståelse af kombinatorisk microenvironmental regulering af celledifferentiering og mechanotransduction.

Interaktioner mellem celler og omgivende microenvironmental faktorer medierer en lang række biologiske processer i hele udvikling, homeostase, og sygdom patogenese 1, 2, 3, 4. Disse microenvironmental interaktioner omfatter levering af opløselige faktorer til celler, celle-matrix binding, og celle-celle-interaktioner via ligand-receptor-binding. Ud over de ovennævnte biokemiske betragtninger biofysiske parametre, såsom substrat mekaniske egenskaber (f.eks, Youngs modul, porøsitet) og celleform, og tilhørende nedstrøms mechanotransduction har i stigende grad vundet anerkendelse som vigtige mediatorer af celledifferentiering 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Signaler som følge af disse microenvironmental interaktioner tjener som input til gen-netværk og signalveje. Desuden er disse celle-iboende komponenter giver også feedback til mikromiljø via udskilles faktorer og matrix-nedbrydende enzymer, der fuldfører en kompleks samregulering loop mellem celle-iboende genetiske programmer og celle-ydre microenvironmental faktorer 5, 11, 12. Anvendelsen af konstruerede systemer til kontrolleret præsentation af microenvironmental faktorer har vist sig nyttige i en række forskellige sammenhænge 13, 14, 15. Mikrofabrikerede systemer i særdeleshed har lettet præcis rumlig mønsterdannelse af proteiner og celler samt parallelt i stor analyse via miniaturisering 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cell microarrays repræsenterer et sådant mikrofabrikerede system, hvor kombinationer af biomolekyler er kontakt-trykt på en elastisk polyacrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Medtagelsen af ​​celle-klæbende komponenter (dvs. matrixproteiner) aktiverer vedvarende celleadhæsion og kultur på mikroarrays, der ofte efterfulgt af nedstrøms analyse via immunocytokemi og fluorescerende reportere. Cell microarrays er produktivt rettet mod at opnå en forbedret forståelse af lever-fænotype 23, 26, neural forløber differentiering 27, Mammary stamfader skæbne beslutninger 28, embryonale stamceller vedligeholdelse / differentiering 23, 29, 30, lungekræft metastase 31, og terapeutisk respons i melanom 32. Vi har for nylig demonstreret brugen af celle- microarrays for at definere rollen af ekstracellulær matrix (ECM) protein sammensætning i endoderm specifikation 33, liver progenitor differentiering 34, 35 og lunge tumor celle lægemiddelrespons 36. I disse værker, har vi fokuseret på at udvide de kombinatoriske evner array-platformen og udforske krydsene med celle-iboende signalering med ekstracellulær matrix sammensætning og biomekanik. Derudover har vi implementeret biofysiske udlæsninger i dette array platform for at tilvejebringe evnen til kvantitativt karakrisere rolle celle kontraktilitet i differentiering processer 35. For at gøre dette, vi integreret trækkraft mikroskopi (TFM) med celle microarrays at aktivere high-throughput vurdering af celle-genereret trækkraft. TFM er en bredt anvendt fremgangsmåde til måling af celle-genereret trækkræfter og har givet betydelige indsigter om koordinering af enkelt-celler og væv-niveau funktion med sammensætningen og biomekanik det lokale mikromiljø 37, 38, 39, 40. Således kombinerer TFM med celle mikroarrays tilvejebringer en høj kapacitet til måling Key, fysiologisk relevante biofysiske parametre. Cellen microarray platform beskrevet her består af fire sektioner: fremstilling af polyacrylamid substrater, fabrikation af arrays, cellekultur og assay udlæsning og analyse af data. SeFigur 1 for en skematisk oversigt over de første tre eksperimentelle sektioner; se figur 2 for en skematisk oversigt over det sidste afsnit med fokus på analyse af immunofluorescens data. For at tilpasse cellen microarray platform til studier af biomekaniske celle-substrat-interaktioner, vi anvendte polyacrylamid substrater af afstemmelige Youngs modul men lignende porøsitet, pr Wen et al. 41. For at aktivere TFM målinger af kræfter, der udøves af celler på deres substrat, vi gennemført en glasbund petriskål format udover den tykke mikroskopglasplader ofte anvendes af andre grupper. Således er denne celle microarray platform er i stand til parallelle målinger af celledifferentiering via immunofluorescens på mikroskopobjektglas og celle-genererede kræfter via TFM på separate glas-bottom retter. Vi har også anvendt flere forbedringer i den analytiske tilgang almindeligt anvendt med celle mikroarrays. bestemt foreskriverly, i stedet for parametrisk Z-scoren for den samlede ø intensitet måler vi encellede intensitet og anvende fraktil normalisering for at tage højde for ikke-normale fordelinger og mere præcist beskriver cellulær adfærd. Vi mener, at disse forbedringer giver særlig anvendelighed over for undersøgelser af biologiske processer, hvor både biokemiske og biofysiske tidskoder spiller væsentlige, krydsende roller. Endvidere vores analytiske forbedringer gør det muligt at anvende celle microarrays til undersøgelser af en række cellulære funktioner, for hvilke encellede og population-niveau adfærd afviger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Mikrofabrikerede cellulære mikroarrays, der består af kontakt-trykte kombinationer af biomolekyler på en elastisk hydrogel overflade, giver en tæt kontrolleret, high-throughput manipuleret system til måling af virkningen af ​​array biokemiske signaler på celledifferentiering. De seneste bestræbelser bruger celle microarrays har vist deres anvendelighed for kombinatoriske undersøgelser, hvor mange microenvironmental faktorer er vist i parallel. Imidlertid har disse bestræbelser primært fokuseret på at undersøge effekten af ​​biokemiske signaler på celle responser. Her præsenteres en celle microarray platform med afstemmelige materialeegenskaber til evaluering både celledifferentiering ved immunfluorescens og biomekaniske celle-substrat-interaktioner ved trækkraft mikroskopi. For at gøre dette, har vi udviklet to forskellige formater udnytte polyacrylamid hydrogeler af varierende Youngs modul fremstillet på enten objektglas eller glas-bottom petriskåle. Vi leverer best praksis og fejlmelding af fremstilling af mikroarrays på disse hydrogel substrater, den efterfølgende cellekultur på mikroarrays, og erhvervelse af data. Denne platform er velegnet til anvendelse i undersøgelser af biologiske processer, for hvilke både biokemiske (f.eks, ekstracellulær matrix sammensætning) og biofysisk (fx substrat stivhed) signaler kan spille betydelige, krydsende roller.

Brug af denne platform, undersøgte vi den rolle, både biokemiske og biofysiske stikord i skæbne specifikation af lever progenitorer 34, 35. Protein A / G-konjugeret Notch-ligander viste forbedret retention og klyngedannelse i polyacrylamid hydrogel (figur 3A) og var desuden i stand til at drive differentiering af lever progenitorer mod en galdegang celleskæbne (figur 3B). Anvendes enkelt-celle analyse, vi kvantificeret reaktionen på kærven ligander for ECM-proteiner collagen I, collagen III, collagen IV, fibronektin og laminin (figur 3C), fastslog, at reaktionen af leveren progenitorer til liganden afhænger også af den ECM sammenhæng. Sidst, vi udnyttet shRNA knockdown at generere lever progenitorer uden liganderne Dll1 og Jag1. Reaktionen på klædt Notch ligand varierede afhængigt af PResence af enten liganden, hvilket bekræfter, at reaktionen på celle-extrinsiske ligand er også en funktion af cellen-intrinsic ligand ekspression (figur 3D). Endvidere observerede vi en tydelig underpopulation af dobbelt-positive (ALB + / OPN +) celler i Dll1 knockdown (figur 3D). Tilsammen udgør disse repræsentative resultater viser: (1) de kombinatoriske evner array format, som eksemplificeret ved parring af multiple klædt ECM-proteiner og Notch-ligander med knockdown af individuelle ligander; (2) funktionaliteten af ​​ikke kun opstillet ECM-proteiner, men også opstillet celle-celle-ligand via protein A / G-medieret konjugering; og (3) gennemførelsen af ​​vores single-celle analyse og dens evne til at skelne unikke subpopulationer. Vi observerede også, at differentieringen af leveren progenitorer er afhængig af både substratet stivhed og ECM sammensætning (figur 4A </str<html> ong&gt;), specifikt at finde, at kollagen IV støtter differentiering på både bløde og stive substrater mens fibronektin understøtter kun differentiering på stive substrater (figur 4B). Repræsentative varme kort over TFM målinger antydede, at vedvarende trækkraft stress ved lav substrat stivhed på kollagen IV fremmet differentiering i galde rørledning celler (figur 4C), en konstatering bekræftes af gennemsnitlige rod-middelværdier-square værdier (Figur 4D). Tilsammen udgør disse repræsentative resultater viser: (1) en vellykket integration af TFM med celle microarrays på substrater med en justerbar stivhed til at vurdere både celle fænotype og trækkraft stress; (2) koordination af leveren progenitorcelle skæbne med både matrixkompositionen og substratet stivhed; og (3) gennemførelsen af ​​vores TFM analyse og typiske trækkraft stress profiler i celle microarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Oversigt Skematisk Viser de første tre Eksperimentelle Sektioner. I afsnit 1, er glassubstrater rengøres og silaniseret at lette fremstillingen af ​​polyacrylamid hydrogeler. I afsnit 2 er biomolekylære kombinationer af interesse udarbejdet i en 384-brønd kilde mikroplade. En robot arrayer derefter fyldt med rene nåle, kilden mikroplade, og polyacrylamid hydrogeler og initialiseret, opdigte arrays på hydrogelerne. I afsnit 3 podes celler på de grupperede domæner og får lov til at klæbe, hvorefter kulturen protokollen af ​​interesse udføres. På endpoint, cellerne enten fastsættes for immuncytokemi / immunofluorescens eller analyseret med TFM. Scale barer er 75 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> inden-side = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figur 2: Behandling og analyse af Immunofluorescens data fra Arrays. (A) Flise-, komposit 32-bit RGB-billeder først arkiveret lodret og derefter opdelt i individuelle 8-bit-kanaler. Ved hjælp af en kombination af grupperede fluorescerende markører og celle øer, er tre hjørner af grupperingen identificeret til at muliggøre automatiseret orientering og klods af grupperingerne. (B) encellede data genereres for hver kanal af input arrays. For at tage højde for eksperimentel drift, er fraktil normalisering anvendes af biologisk gentagelse, der producerer en enkelt delt fordeling på tværs af alle gentagelser. Fraktil normaliseret data efterfølgende plottet og fortolkes via beregning af ensemble-målinger (fx celler / ø, betyder intensitet, procentvise celler er positive for en etiket) eller direkte analyse af encellede distributioner.m / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figur 3: Notch ligand Præsentation formidler Lever progenitorceller Differentiering. (A) Fc-rekombinant Notch ligander Jagged-1 (JAG1) og Delta-lignende 1 (DLL1) udstillet forbedret fastholdelse og klyngedannelse, når klædt med protein A / G. Scale bar er 50 um. (B) Lever progenitorer differentieret i galde rørledning celler mod forevisning med Notch ligand. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) er et nukleart etiket, albumin (ALB) er en hepatisk celle markør, og osteopontin (OPN) er et galdegang cellemarkør. Scale bar er 150 um. (C) Kvantificering af procentdelen af celler positive for OPN for Notch-ligander JAG1, DLL1, og Delta-lignende 4 (DLL4) på ECM-proteiner kollagen I, collagen III, collagen IV, fibronektin og laminin. Students t -tests blev udført mod kontrol IgG for hvert array Notch-ligand inden for hver ECM protein med P-værdier indikeret for P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytometri af ALB og OPN for celler på kollagen III præsenteret med Notch ligander JAG1, DLL1, og DLL4. Lever progenitorer uden Notch ligander Dll1 og Jag1 (dvs. shDll1 og shJag1) blev dannet ved anvendelse shRNA knockdown. Data i (C) præsenteres som gennemsnit ± sem Dette tal har været ændret siden Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figur 4: Matrix Sammensætning og Substrat Stivhed Coordinate Lever progenitorceller Differentiering. (A) Lever progenitor differentiering til galdegangsceller er afhængig af både ECM sammensætning og substrat stivhed. DAPI er en nuklear etiket, ALB er en hepatisk celle markør, og OPN er en galdegang cellemarkør. (B) Kvantificering af procentdelen af celler positive for OPN på substrater af Youngs modul 30 kPa, 13 kPa, og 4 kPa for collagen I (C1), collagen IV (C4), fibronektin (FN), og alle tovejskombinationer af disse ECM-proteiner. (C) Cell trækkraft stress er afhængig af både substrat stivhed og ECM sammensætning. (D) Kvantificering af root middelværdi square værdier af trækkraft stress på substrater af Youngs modul 30 kPa og 4 kPa for collagen I (C1), collagen IV (C4), fibronectin (FN), og alle tovejs kombinationer af disse ECM-proteiner. I (B) og (D) blev data præsenteret som middelværdi ± SEM og Students t -testsblev udført mod 30 kPa for hvert ECM kombination med P-værdier indikeret for P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) og P &lt;0,001 (***). Scale barer er 50 um. Dette tal har været ændret siden Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Afsnit </td><td fo:width="1.5in"> Problem </td><td fo:width="1.5in"> Potentielle årsager </td><td> Løsning </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fremstilling af Polyacrylamide substrat. </td><td> Dækglas kan ikke fjernes fra hydrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reducere polymerisation tid til &lt;10 minutter (4 W / m2). Kontroller, at UV crosslinker output er inden forventet interval. </td></tr><tr><td> Dårlig polyacrylamid hydrogel polymerisation. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Øge polymerisation tid til&gt; 10 minutter (4 W / m2). Kontroller at UV tværbinder output er inden forventet interval. </td></tr><tr><td> Polyacrylamid-hydrogeler er beskadiget efter fjernelse af dækglas. </td><td> Bløde polyacrylamid hydrogeler er nemme at skade. </td><td> Vi observerer faldende hydrogel fabrikation udbytte (~ 50%) for den blødeste (dvs. 4 kPa) hydrogeler i særdeleshed. Håndtag hydrogeler blidt og øge startnumre til at nå det ønskede udbytte. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Fabrikation af Arrays. </td><td rowspan="2"> Dårlig eller inkonsekvent spot morfologi. </td><td> Inkonsekvent luftfugter funktion. </td><td> Kontroller at luftfugter og rheometer en funktionel hele hver oplag og fastholde 65% relativ luftfugtighed. </td></tr><tr><td> Pins fast i printhovedet eller træskoGed. </td><td> Rens skrivehovedet for at tillade fri pin bevægelse. Rengør stifter grundigt før eller efter hver oplaget at fjerne aggregater fra pin-kanaler. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cell Culture og Assay Execution. </td><td rowspan="2"> Cellefrigørelse eller død på arrays efter indledende vedhæftet fil. </td><td> Eftersåning og overdreven proliferation. </td><td> Reducer indledende seeding tæthed og tid. Brug &quot;vedligeholdelse&quot; eller &quot;differentiering&quot; medier under vifte kultur for at reducere celleproliferation. </td></tr><tr><td> Frigivelse af giftige acrylamid monomer fra hydrogel. </td><td> Soak hydrogeler i dH 2 O i mindst 3 d at give mulighed for diffusion / frigivelse af acrylamid monomer og reducere celle toksicitet. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Celler ikke tillægger arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Øg indledende seeding tæthed og tid. Brug en stærkere klæbende celletype. </td></tr><tr><td> Dårlig aflejring afmatrix eller biomolekyle tilstand. </td><td> Rene stifter af partikler og aggregater, bekræfter udskrivning parametre, og evaluere spotting af fluorescerende markører, fx rhodamin-konjugeret dextran. </td></tr><tr><td> Specificitet af celle-matrix interaktioner. </td><td> Forskellige celletyper klæber specifikt til nogle, men ikke andre ECM-proteiner. Teste flere forskellige ECM-proteiner med dine celler. </td></tr><tr><td> Suboptimal vifte opbevaring efter fabrikation. </td><td> Vi anbefaler lagring fabrikerede arrays natten over ved 65% RH og stuetemperatur, dels at undgå faseændringer under frysning. Celleadhæsion er følsom over for både fugtighed, temperatur og lagringstid; sørge for disse parametre er konsekvente / optimeret til dine eksperimenter. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Frigørelse af hydrogel fra glassubstratet under celledyrkning. </td><td> Dårlig slide rengøring og silanisering. </td><td> Udskift arbejder løsninger til slide rengøring ogsilanisering. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hydrogel. </td><td> Lad ikke hydrogeler dehydrerende på en varmeplade i mere end 15-30 min. </td></tr><tr><td> 4. Analyse af data. </td><td> Høj variation mellem replikere pletter og dias. </td><td> Variation i matrix fabrikation. </td><td> Kontroller at stifter og skrivehovedet er rene. Bekræft luftfugter funktion. Visualiser og kvantificere spot og array kvalitet ved hjælp af fluorescerende markører. Opbevar arrays som anbefalet ovenfor. </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Fejlfinding.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Celledifferentiering er reguleret af en række microenvironmental faktorer, herunder både matrix sammensætning og substrat materialeegenskaber. Vi beskriver her en teknik under anvendelse af celle microarrays sammenholdt med trækkraft mikroskopi at evaluere både celledifferentiering og biomekaniske celle-substrat-interaktioner som funktion af microenvironmental kontekst.

En High-throughput Cell Microarray Platform for korrelative Analyse af Cell Differentiering og Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselsammensætning som en 3D-platform for Formering og differentiering af humane embryonale stamceller (embryonale) til forskellige linier

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

High Throughput Enkelt-celle og Multiple-celle mikroindkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelativ mikroskopi til 3D Strukturel analyse af dynamiske vekselvirkning

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En alsidig Automatiseret platform for Micro-skala cellestimulering Eksperimenter

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching Platform for Applications i cellebiologi og Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...