Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Wij erkennen Austin Cyphersmith en Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign) voor hulp bij microscopie en voor royaal opvang scherm en video-opname op de microscopie kern.

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

In onze experimenten hebben we gevonden dat de meest voorkomende fouten zijn gerelateerd aan de kwaliteit van de gefabriceerde arrays en slecht kenmerk reactie in het biologische systeem plaats. Wij verwijzen de lezer naar tabel 1 voor de gemeenschappelijke storingsmodi in cel microarray experimenten en bijbehorende stappen voor probleemoplossing. Ten aanzien van de kwaliteit van arrays in het bijzonder, raden wij u het volgende. Bevestigen de technische kwaliteit en de robuustheid van arraying&#39;s, parameters en buffers gebruikt fluorescerend gemerkte moleculen zoals rhodamine geconjugeerd dextran. Grondig reinigen pennen voor of na het rangschikken van de instructies van de fabrikant en verder visueel te controleren of de pin-kanalen zijn vrij van afval met behulp van een lichtmicroscoop. Bevestig gekleed biomolecuul retentie met behulp van algemeen eiwit vlekken of immunokleuring. Merk op dat biomoleculen met een molecuulgewicht lager dan 70 kDa vaak niet vastgehouden in de hydrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Valideren gekleed biomolecuul cell-functionaliteit met behulp van meerdere celtypen. Merk op dat alleen hechtende cellen geschikt arrays; bovendien, hechting aan matrices afhankelijk van zowel cel-specifieke eigenschappen (bijvoorbeeld integrine expressieprofiel) en de geselecteerde ECM eiwitten. Vanwege de beperkte ruimte, hebben we niet voorzien van een uitgebreide behandeling van de array ontwerp, de indeling en fabricage hier en verwijzen de lezer naar de vorige werkt 23, 25. Wij gebruiken over het algemeen 100 spot subarrays (150 micrometer spot diameter van 450 micrometer hart-op-hart afstand), bestaande uit 10-20 unieke biomolecuul zijn uitgevoerd (5-10 vlekken / conditie). Het aantal subarrays in een matrix is ​​afhankelijk van het aantal biologische molecule voorwaarden plaats, die comfortabel tot 1280 worden geschaald op een 25 x 75 mm objectglaasje (~ 6400 spots in 64 subarrays)xref &quot;&gt; 25, 31 de parameters hierboven verder afhankelijk van de patroongrootte plaats;. pinnen kunnen genereren patronen 75-450 urn zijn beschikbaar. Array experimenten worden best aangevuld met validatie van hoog scorende gekleed omstandigheden van belang het gebruik van andere cultuur formats, assay uitlezingen, en biologische modelsystemen. In het bijzonder, raden we verder valideren effecten van geselecteerde gekleed omstandigheden met behulp van bulk culturen in combinatie met standaard moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld qRT-PCR, immunoblotting) of standaard TFM. Genetische manipulatie (bijv knock-down of overexpressie) van de factor van belang in een geschikte biologische modelsysteem kan ook dienen om effecten waargenomen in arrays te bevestigen. In vivo diermodellen vertegenwoordigen een ander middel voor validatie en werden onlangs gebruikt, bijvoorbeeld, de centrale rol van galectine-3 en galectine-8 bevestigtde longkanker metastatische niche, zoals aanvankelijk geïdentificeerd via de mobiele microarray 31, 49. Een aantal andere methoden zijn gebruikt om micro-omgeving regulatie van cellulaire functies, waaronder een verscheidenheid aan tweedimensionale microvervaardigde systemen 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 en driedimensionale engineered biomateriaal systemen 56, 57, 58 probe , 59, 60, 61. In vergelijking met andere werkwijzen, de bijzondere voordelen van de cel microarrayplatform beschreven omvatten: (1) tot doorvoerhonderden of duizenden verschillende combinaties van factoren, waardoor analyse van de interactie-effecten; (2) toegankelijk, geautomatiseerde beeldvorming en analyse; (3) integratie van beide biochemische en biofysische uitlezingen met gecontroleerde presentatie van gekleed factoren; (4) het vermogen om substraat materiaaleigenschappen variëren; en (5) met hoge gehalte single-cell analyse van het lot van de cel en functie. Samengevat, de combinatie van cel microarrays met TFM op substraten afstembare substraat stijfheid maakt grondige karakterisatie van zowel biochemische en biofysische cues. Zoals hier gepresenteerde dit platform generaliseerbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van hechtende celtypen en weefsels context naar een beter begrip van combinatorische micro-omgeving regulering van celdifferentiatie en mechanotransductie.

Interacties tussen cellen en micro-omgeving rondom factoren mediëren een grote verscheidenheid van biologische processen in ontwikkeling, homeostase en ziekte pathogenese 1, 2, 3, 4. Deze micro-omgeving interacties omvatten afgifte van oplosbare factoren aan cellen, cel-matrix binding en cel-cel interacties via ligand-receptorbinding. Naast bovengenoemde biochemische overwegingen biofysische parameters, zoals substraat mechanische eigenschappen (bijvoorbeeld modulus, porositeit) en celvorm en bijbehorende downstream mechanotransductie steeds erkenning gekregen als belangrijke mediatoren van celdifferentiatie 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Signalen als gevolg van deze micro-omgeving interacties dienen als input voor gen-netwerken en signaalwegen. Bovendien zijn deze cel-intrinsieke componenten ook feedback aan de micro-omgeving door factoren en matrix-afbrekende enzymen, het invullen van een complex mederegulerende loop tussen cel-intrinsieke genetische programma en cel-extrinsieke factoren micromilieu 5, 11, 12. Het gebruik van technische systemen voor gecontroleerde weergave van micro-omgeving factoren is nuttig gebleken in een aantal verschillende contexten 13, 14, 15. Microfabricated systemen hebben vooral nauwkeurige ruimtelijke patronen van eiwitten en cellen evenals zeer parallel verlopende analyse vergemakkelijkt via miniaturisatie 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cel microarrays vertegenwoordigen zo&#39;n microfabricated systeem waarin combinaties van biomoleculen contact gedrukt op een elastische polyacrylamide hydrogel substraat 23, 24, 25. De opname van cel-hechtende componenten (namelijk matrixeiwitten) maakt aanhoudende celadhesie en cultuur microarrays, die vaak gevolgd wordt door stroomafwaartse analyses via immunocytochemie en fluorescerende reporters. Cel microarrays zijn productief gericht op het bereiken van een beter begrip van de levercel fenotype 23, 26, neurale voorloper differentiatie 27, Mammary progenitor lot besluiten 28, embryonale stamcel onderhoud / differentiatie 23, 29, 30, 31 longkanker metastase en therapeutische respons in 32 melanoom. We hebben onlangs aangetoond dat het gebruik van mobiele microarrays voor de rol van extracellulaire matrix (ECM) eiwitsamenstelling in endoderm specificatie 33, leverprogenitor- differentiatie 34, 35 en longtumorcellijnen geneesmiddelrespons 36. In deze werken, hebben we ons gericht op de uitbreiding van de combinatorische mogelijkheden van de array-platform en het verkennen van de snijpunten van de cel-intrinsieke signalering met extracellulaire matrix compositie en biomechanica. Daarnaast hebben we biofysische uitlezingen uitgevoerd in deze array platform de mogelijkheid bieden om kwantitatief karakterize de rol van de cel contractiliteit in differentiatie verwerkt 35. Om dit te doen, geïntegreerd we trekkracht microscopie (TFM) met een mobiele microarrays om high-throughput evaluatie van de cel gegenereerd tractie mogelijk te maken. TFM is een algemeen gebruikte methode om cellen gegenereerde aandrijfkrachten meten en heeft belangrijke inzichten over de coördinatie van eencellige en weefsel functie op de samenstelling en biomechanica van de lokale micro-omgeving 37, 38, 39, 40 voorzien. Zo, een combinatie van TFM met mobiele microarrays zorgt voor een high-throughput-systeem voor het meten van de belangrijkste, fysiologisch relevante biofysische parameters. De cel microarrayplatform hier beschreven bestaat uit vier delen: vervaardiging van polyacrylamide substraten fabricage van arrays, celkweek en assay uitlezen en analyseren van gegevens. ZienFiguur 1 een schematische samenvatting van de eerste drie experimentele punten; zie figuur 2 voor een schematisch overzicht van het laatste deel met een focus op de analyse van immunofluorescentie gegevens. Om de cel microarrayplatform studies van biomechanische cel- substraatinteracties passen, gebruikten we polyacrylamide substraten afstembare Young&#39;s modulus maar vergelijkbaar porositeit, per Wen et al. 41. Om TFM metingen van krachten uitgeoefend door cellen op hun substraat mogelijk voerden we een glazen bodem petrischaal format naast de dikke objectglaasjes vaak gebruikt door andere groepen. Zo, deze cel microarray platform is in staat om parallelle metingen van celdifferentiatie via immunofluorescentie op microscoopglaasjes en cel gegenereerde krachten via TFM op aparte glazen bodem gerechten. We hebben ook verschillende verbeteringen aangebracht op de analytische courante methode met een mobiele microarrays. specifically, in plaats van parametrische Z-scoring van de totale eiland intensiteit, meten we eencellige intensiteit en toe te passen kwantiel normalisatie om rekening te houden met niet-normale verdelingen en meer nauwkeurig te beschrijven cellulaire gedrag. Wij geloven dat deze verbeteringen te verstrekken bijzonder nut in de richting van onderzoek naar biologische processen waarin zowel biochemische en biofysische signalen spelen significant, snijdende rollen. Verder onze analytische verbeteringen maken de toepassing van cel microarrays studies van diverse cellulaire functies waarvoor eencellige en populatie niveau gedrag verschillen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Microfabricated cellulaire microarrays, die bestaan ​​uit contact gedrukt combinaties van biomoleculen op een elastisch hydrogel oppervlak te strak, high-throughput systeem ontworpen om het effect van array biochemische signalen op celdifferentiatie. Recente inspanningen met behulp van mobiele microarrays hebben hun nut voor combinatorische studies waarin veel micro-omgeving factoren worden gepresenteerd in parallel aangetoond. Echter, deze pogingen voornamelijk gericht op het onderzoeken van de effecten van biochemische signalen op cel reacties. Hier presenteren we een cel microarray platform met instelbare materiaaleigenschappen gaan zowel celdifferentiatie door immunofluorescentie en biomechanische cel substraatinteracties door trekkracht microscopie. Hiervoor hebben we twee verschillende formaten gebruikmaking polyacrylamide hydrogels variërende elasticiteitsmodulus vervaardigd aan beide microscoopglaasjes of glazen bodem petrischalen ontwikkeld. Wij bieden best praktijken en het oplossen van problemen voor de fabricage van microarrays op deze hydrogel substraten, de daaropvolgende celcultuur op microarrays, en de overname van gegevens. Dit platform is zeer geschikt voor toepassing bij onderzoek naar biologische processen die zowel biochemische (bijvoorbeeld extracellulaire matrix compositie) en biofysische (bijvoorbeeld substraat stijfheid) signalen kunnen aanzienlijke spelen, snijdende rollen.

Gebruik dit platform, hebben we de rol van zowel de biochemische en biofysische signalen in het lot specificatie van Leverprogenitoren 34, 35. Proteïne A / G-geconjugeerd Notch ligands liet verbeterd tegenhouden en clustering in de polyacrylamide hydrogel (figuur 3A) en zijn bovendien het aansturen van differentiatie van Leverprogenitoren naar een galgang lot van de cel (figuur 3B). Gebruik eencellige analyse hebben we gekwantificeerd de reactie op de Notch liganden voor de ECM eiwitten collageen I, collageen III, collageen IV, fibronectine en laminine (figuur 3C), vastgesteld dat de reactie van Leverprogenitoren het ligand hangt ook af van de ECM context. Last, benut we shRNA knock-down te Leverprogenitoren genereren zonder dat de liganden Dll1 en Jag1. De respons op de array Notch ligand varieerde afhankelijk van de presence van ofwel ligand bevestigt de respons van de cel-extrinsieke ligand is ook een functie van de cel-intrinsieke ligand expressie (Figuur 3D). Verder zagen we een duidelijke subpopulatie van dubbel-positieve (ALB + / OPN +) cellen in de Dll1 knock-down (Figuur 3D). Samen vormen deze representatieve resultaten tonen: (1) de combinatoriële mogelijkheden van de array format, zoals blijkt uit de koppeling van meerdere ECM-eiwitten opgesteld en Notch ligands de knockdown van afzonderlijke liganden; (2) de functie van niet alleen bekleed ECM eiwitten ook gerangschikt cel- ligand via proteïne A / G-gemedieerde conjugatie; en (3) de uitvoering van onze single-cell analyse en de mogelijkheid om unieke subpopulaties onderscheiden. We hebben ook waargenomen dat de differentiatie van progenitors lever is afhankelijk van zowel het substraat stijfheid en de ECM samenstelling (figuur 4A </str<html> ong&gt;), in het bijzonder het vinden van dat collageen IV is voorstander van differentiatie op zowel zacht en stijve substraten terwijl fibronectine alleen ondersteuning voor differentiatie op harde ondergronden (Figuur 4B). Representatieve warmtekaarten van TFM metingen voorgesteld aanhoudende trek wordt belast bij lage substraat stijfheid op collageen IV bevorderde differentiatie in bile duct cellen (Figuur 4C), een bevinding bevestigd gemiddelde wortel van het gemiddelde kwadraat waarden (Figuur 4D). Samen vormen deze representatieve resultaten tonen: (1) de succesvolle integratie van TFM met mobiele microarrays op substraten met een instelbare stijfheid zowel de cel fenotype en trek wordt belast, te beoordelen; (2) de coördinatie van de lever voorlopercellen lot van de cel met zowel de matrix samenstelling en het substraat stijfheid; en (3) de implementatie van onze TFM analyse en typische tractie stress-profielen in cel microarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Overzicht schematische weergave van de eerste drie Experimental secties. In paragraaf 1, worden glassubstraten schoongemaakt en gesilaniseerd om de fabricage van polyacrylamide hydrogels te vergemakkelijken. In hoofdstuk 2, worden de biomolecuul combinaties van belang bereid in een 384-wells microplaat bron. Een array-robot wordt dan geladen met schone pennen, de bron microplaat en de polyacrylamide hydrogels en geïnitialiseerd, vervaardigen arrays op de hydrogelen. In paragraaf 3 worden cellen gezaaid op de gekleed domeinen en liet zich te houden, waarna de cultuur protocol van belang is uitgevoerd. Op het eindpunt worden de cellen ofwel gefixeerd voor immunocytochemie / of immunofluorescentie geanalyseerd met TFM. Schaal bars zijn 75 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> binnen-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figuur 2: Verwerking en analyse van immunofluorescentie gegevens van arrays. (A) Tegels, samengestelde 32-bits RGB-afbeeldingen worden eerst weggegooid en vervolgens te splitsen in afzonderlijke 8-bit kanalen. Een combinatie van fluorescente markers bekleed en mobiele eilanden worden drie hoeken van de array gemerkt zijn dat voor automatische oriëntatie en netten in de arrays. (B) Eencellige data wordt gegenereerd voor elk kanaal van de input arrays. Om rekening te houden experimentele drift, wordt quantile normalisatie toegepast door biologische repliceren, waardoor een enkele gedeelde verdeling over alle replicaten. Kwantiel genormaliseerde data wordt vervolgens uitgezet en geïnterpreteerd via de berekening van ensemble metingen (bijvoorbeeld cellen / eiland, gemiddelde intensiteit, het percentage cellen positief voor een label) of een directe analyse van single-cell distributies.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figuur 3: Notch Ligand Presentatie Bemiddelt Lever Progenitor Differentiatie. (A) Fc-recombinant Notch liganden Jagged-1 (JAG1) en Delta-like 1 (DLL1) tentoongesteld verbeterde retentie en clustering wanneer bekleed met proteïne A / G. Schaal bar is 50 micrometer. (B) Leverprogenitoren gedifferentieerd in galweg cellen na presentatie met Notch ligand. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is een nucleaire label, albumine (ALB) is een lever cel marker, en osteopontine (OPN) is een galwegen cel marker. Schaal bar is 150 pm. (C) Kwantificering van het percentage cellen positief voor OPN voor de Notch liganden JAG1, DLL1, en Delta-achtige 4 (DLL4) op de ECM eiwitten collageen I, collagen III, collageen IV, fibronectine en laminine. Student&#39;s t -testen werden uitgevoerd tegen controle IgG voor elk getooid Notch ligand binnen elke ECM-eiwit met P-waarden geïndiceerd voor P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytometrie van ALB en OPN voor cellen op collageen III aangeboden met de Notch liganden JAG1, DLL1 en DLL4. Leverprogenitoren zonder Notch liganden Dll1 en Jag1 (dwz shDll1 en shJag1) werden gegenereerd met behulp van shRNA knock-down. Gegevens in (C) gepresenteerd als gemiddelde ± SEM Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figuur 4: Matrix Samenstelling en Substrate stijfheid Coordinate Lever Progenitor Differentiatie. (A) Lever voorlopercellen differentiatie ductale cellen gal afhankelijk van zowel ECM samenstelling en substraat stijfheid. DAPI is een nucleaire label, ALB is een lever cel marker, en OPN is een galweg cel marker. (B) Kwantificering van percentage cellen positief voor OPN op substraten van Young&#39;s modulus 30 kPa, 13 kPa, en 4 kPa voor collageen I (C1), collageen IV (C4), fibronectine (FN) en alle wederzijdse combinaties de ECM eiwitten. (C) Cell trek wordt belast, afhankelijk van zowel substraat stijfheid en ECM samenstelling. (D) Kwantificering root-mean-square waarden trek wordt belast op substraten van Young&#39;s modulus 30 kPa en 4 kPa voor collageen I (C1), collageen IV (C4), fibronectine (FN) en alle wederzijdse combinaties van deze ECM eiwitten. In (B) en (D), werden gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM en Student&#39;s t -testenwerden uitgevoerd op 30 kPa per ECM combinatie met P-waarden dienen P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) en P &lt;0,001 (***). Schaal bars zijn 50 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sectie </td><td fo:width="1.5in"> Probleem </td><td fo:width="1.5in"> mogelijke oorzaken </td><td> Oplossing </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabricage van Polyacrylamide substraat. </td><td> Dekglaasje kan niet van hydrogel verwijderd. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Verminder polymerisatietijd tot &lt;10 minuten (4 W / m 2). Controleer of UV crosslinker output is binnen de verwachte range. </td></tr><tr><td> Slechte polyacrylamide hydrogel polymerisatie. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Polymerisatietijd verhogen tot&gt; 10 minuten (4 W / m 2). Controleer of de UV-crosslinker output is binnen de verwachte range. </td></tr><tr><td> Polyacrylamide hydrogels beschadigd na verwijdering van dekglaasje. </td><td> Zachte polyacrylamide hydrogels zijn gemakkelijk te beschadigen. </td><td> We zien afnemende hydrogel fabricage opbrengst (~ 50%) van de zachtste (dwz 4 kPa) hydrogels in het bijzonder. Handvat hydrogels zacht en verhogen startnummers om gewenste opbrengst te bereiken. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Vervaardiging van arrays. </td><td rowspan="2"> Slechte of inconsistente spot morfologie. </td><td> Inconsistent luchtbevochtiger functie. </td><td> Controleer of de luchtbevochtiger en Rheometer een functioneel gedurende de hele oplage en onderhouden van 65% RV. </td></tr><tr><td> Pins vast te zitten in de printkop of klompged. </td><td> Reinig de printkop mogelijk te maken voor vrije pin beweging. Clean pennen grondig voor of na elke oplage aggregaten van pin-kanalen te verwijderen. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cel Cultuur en Assay Execution. </td><td rowspan="2"> Cell onthechting of overlijden op arrays na de eerste bijlage. </td><td> Bovenuitzaai en overmatige proliferatie. </td><td> Verminder initiële zaaidichtheid en tijd. Gebruik &quot;onderhoud&quot; of &quot;differentiatie&quot; media tijdens scala cultuur tot celproliferatie te verminderen. </td></tr><tr><td> Vorming van giftige acrylamide monomeer uit hydrogel. </td><td> Genieten hydrogels in dH 2 O tenminste 3 d om diffusie / vrijgave van acrylamide monomeer en verminderen celtoxiciteit. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Cellen niet hechten aan arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Verhoging van de initiële zaaidichtheid en tijd. Gebruik een sterker hechtende celtype. </td></tr><tr><td> Slechte afzetting vanmatrix of biomolecuul conditie. </td><td> Clean pinnen van deeltjes en aggregaten, bevestigen afdrukken parameters, en het spotten van fluorescente markers, bijvoorbeeld rhodamine-geconjugeerde dextran te evalueren. </td></tr><tr><td> Specificiteit van cel-matrix interacties. </td><td> Verschillende celtypen zich specifiek op sommige, maar niet andere ECM eiwitten. Test meerdere verschillende ECM eiwitten met je cellen. </td></tr><tr><td> Suboptimale scala opslag na fabricage. </td><td> We raden het opslaan van gefabriceerde arrays &#39;s nachts bij 65% relatieve vochtigheid en kamertemperatuur, voor een deel aan fase veranderingen tijdens bevriezing te voorkomen. Celhechting gevoelig voor zowel vocht, temperatuur en opslagtijd; zorg ervoor dat deze parameters zijn consistent / geoptimaliseerd voor uw experimenten. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Detachement van hydrogel van glassubstraat tijdens celkweek. </td><td> Slechte slide reiniging en silaneren. </td><td> Vervang werkende oplossingen voor het reinigen en slidesilaneren. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hydrogel. </td><td> Niet hydrogels dehydrateren op een hete plaat langer dan 15-30 minuten te verlaten. </td></tr><tr><td> 4. Analyse van de gegevens. </td><td> Hoge variabiliteit tussen repliceren plekken en glijbanen. </td><td> Variabiliteit in serie fabricage. </td><td> Controleer of de pinnen en printkop schoon zijn. Bevestig luchtbevochtiger functie. Visualiseren en kwantificeren spot en de vele kwaliteit met fluorescerende markers. WINKEL arrays zoals hierboven aanbevolen. </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Problemen oplossen.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...