Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
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Nous reconnaissons Austin Cyphersmith et Mayandi Sivaguru (Carl R. Institut Woese génomique de la biologie, Université de l&#39;Illinois à Urbana-Champaign) pour l&#39;assistance à la microscopie et généreusement accueillir l&#39;écran et la capture vidéo au cœur de la microscopie.

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans nos expériences, nous avons constaté que les défaillances les plus courantes sont liées à la qualité des matrices fabriquées et mal caractérisés réponse dans le système biologique d&#39;intérêt. Nous renvoyons le lecteur au tableau 1 pour les modes de défaillance communs dans les expériences de puces à ADN cellulaire et les étapes de dépannage associées. En ce qui concerne la qualité des réseaux, en particulier, nous recommandons ce qui suit. Confirmer la qualité technique et la robustesse des programmes, paramètres rangeant, et des tampons en utilisant des molécules marquées par fluorescence tels que la rhodamine conjuguée dextran. broches Nettoyer soigneusement avant ou après les rangeant par les instructions du fabricant et en outre vérifier visuellement que les canaux de broches sont claires des débris à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Confirmer la rétention de biomolécules Arrayed utilisant les taches de protéines générales ou immunomarquage. A noter que les biomolécules ayant un poids moléculaire inférieur à 70 kDa sont souvent pas conservés dans 23 l&#39;hydrogel, </<html> sup&gt; 31. Valider biomolécules Arrayed cellule-fonctionnalité en utilisant plusieurs types de cellules. Notez que seules les cellules adhérentes sont compatibles avec les tableaux; En outre, l&#39; adhésion à des réseaux dépend à la fois des propriétés spécifiques à des cellules (par exemple, le profil d&#39;expression de l&#39; intégrine) et les protéines d&#39;ECM sélectionnées. En raison de l&#39; espace limité, nous avons pas fourni un traitement extensif de conception de réseau, mise en page, et la fabrication ici et renvoyer le lecteur aux travaux antérieurs 23, 25. Nous utilisons généralement 100 sous - réseaux au comptant (150 diamètre um spot, 450 um de distance de centre à centre) composé de 10-20 conditions de biomolécules uniques (c. -à- 5-10 points / état). Le nombre de sous-réseaux dans un réseau varie en fonction du nombre de conditions biomolécules d&#39;intérêt, qui peut être confortablement étendu pour 1.280 sur un 25 × 75 mm lame de microscope (~ 6400 points dans 64 sous-réseaux)xref &quot;&gt; 25 31 Les paramètres ci - dessus en outre varier en fonction de la taille du motif d&#39;intérêt;. broches capables de générer des modèles de 75 à 450 um sont facilement disponibles. expériences de tableau sont mieux complétés par la validation de haute notation conditions disposées d&#39;intérêt en utilisant d&#39;autres formats de culture, des lectures d&#39;essai, et des systèmes de modèles biologiques. Plus précisément, nous vous recommandons de valider davantage les effets des conditions choisies disposées en utilisant des cultures en vrac conjointement avec des techniques standard de biologie moléculaire (par exemple, qRT-PCR, immunoblotting) ou la norme TFM. La manipulation génétique (par exemple, knockdown ou surexpression) du facteur d&#39;intérêt dans un système modèle biologique approprié peut également servir à confirmer les effets observés dans des tableaux. In vivo des modèles animaux représentent un autre moyen de validation et ont été récemment utilisés, par exemple, de confirmer le rôle central de la galectine-3 et la galectine-8le cancer du poumon métastatiques créneau, comme initialement identifié par puce à ADN de la cellule 31, 49. Un certain nombre d&#39;autres méthodes ont été utilisées pour sonder la régulation microenvironnement de fonctions cellulaires, y compris une variété de bidimensionnelles systèmes micro - usinés 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 et des systèmes tridimensionnels biomatériau d&#39; ingénierie 56, 57, 58 , 59, 60, 61. En comparaison avec d&#39;autres méthodes, les avantages particuliers de la plate-forme de puces à ADN cellulaire décrits ici comprennent: (1) Débit jusqu&#39;àdes centaines ou des milliers de différentes combinaisons de facteurs, ce qui permet l&#39;analyse des effets de l&#39;interaction; (2) accessible, l&#39;imagerie et l&#39;analyse automatisée; (3) l&#39;intégration des deux lectures biochimiques et biophysiques avec présentation contrôlée de facteurs disposés; (4) l&#39;aptitude à faire varier les propriétés du matériau du substrat; et (5) à haute teneur en analyse unicellulaire du destin et de la fonction cellulaire. En résumé, la combinaison des microréseaux cellulaires avec TFM sur des substrats de rigidité du substrat accordable permet la caractérisation complète des deux indices biochimiques et biophysiques. Tel que présenté ici, cette plate-forme est généralisable et peut être facilement appliquée à une variété de types de cellules adhérentes et des contextes de tissus vers une meilleure compréhension de la régulation de microenvironnement combinatoire de la différenciation cellulaire et la mécanotransduction.

Les interactions entre les cellules et les facteurs environnants microenvironnementales médient une grande variété de processus biologiques au cours du développement, l&#39; homéostasie et la maladie pathogenèse 1, 2, 3, 4. Ces interactions comprennent l&#39;administration microenvironnement de facteurs solubles à des cellules, la liaison cellule-matrice et interactions cellule-cellule par l&#39;intermédiaire de la liaison ligand-récepteur. En plus des considérations biochimiques ci - dessus, les paramètres biophysiques, comme les propriétés mécaniques du substrat (par exemple, le module de Young, de la porosité) et la forme des cellules, et mécanotransduction aval associé ont de plus en plus gagné la reconnaissance en tant que médiateurs clés de la différenciation des cellules 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Les signaux résultant de ces interactions microenvironnementales servent comme entrées aux réseaux de gènes et les voies de signalisation. En outre, ces composants cellulaires intrinsèques fournissent également une rétroaction au microenvironnement par des facteurs sécrétés et des enzymes dégradant la matrice, complétant une boucle de corégulation complexe entre les programmes génétiques cellulaires intrinsèques et des facteurs cellulaires extrinsèque microenvironnementales 5, 11, 12. L&#39;utilisation de systèmes d&#39; ingénierie pour la présentation contrôlée des facteurs microenvironnement est avéré utile dans une gamme de contextes différents 13, 14, 15. Systèmes microfabriqués en particulier ont facilité la structuration spatiale précise des protéines et des cellules ainsi que des analyses hautement parallélisée via la miniaturisation 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Les puces à cellules représentent un tel système micro - usiné , dans lequel les combinaisons de biomolécules sont des contacts imprimés sur un substrat en hydrogel de polyacrylamide élastique 23, 24, 25. L&#39;inclusion de composants cellulaires-adhésif (à savoir les protéines de la matrice) permet une adhérence soutenue de culture cellulaire et sur les microréseaux, qui est souvent suivie d&#39;une analyse en aval par l&#39;intermédiaire d&#39;immunocytochimie et reporters fluorescents. Microréseaux cellulaires ont été productifs orientés vers la réalisation d&#39; une meilleure compréhension du phénotype des cellules du foie 23, 26, la différenciation des précurseurs de neurones 27, Mammardécisions y progéniteur du devenir 28, embryonnaires cellules souches d&#39; entretien / différenciation 23, 29, 30, poumon métastases du cancer 31, et réponse thérapeutique dans le mélanome 32. Récemment , nous avons démontré que l&#39;utilisation de puces à ADN de la cellule pour définir le rôle de la matrice extracellulaire (ECM) Composition de la protéine dans la description de l&#39; endoderme 33, la différenciation des progéniteurs du foie 34, 35, et une tumeur du poumon réponse aux médicaments des cellules 36. Dans ces travaux, nous avons mis l&#39;accent sur l&#39;extension des capacités combinatoires de la plate-forme de réseau et d&#39;explorer les intersections de la signalisation cellulaire intrinsèque avec la composition et la biomécanique de la matrice extracellulaire. En outre, nous avons mis en œuvre des lectures biophysiques cette plate-forme de réseau pour fournir la capacité de quantitativement caracponctuent la le rôle de la contractilité des cellules dans la différenciation des processus 35. Pour ce faire, nous avons intégré la microscopie à force de traction (TFM) avec des microréseaux cellulaires pour permettre une évaluation à haut débit de traction générée cellulaire. TFM est une méthode largement utilisée pour mesurer des forces de traction générées cellules et a fourni des informations importantes concernant la coordination de la cellule unique et une fonction de niveau de tissu avec la composition et biomécanique du microenvironnement local 37, 38, 39, 40. Ainsi, en combinant TFM avec des microréseaux cellulaires fournit un système à haut débit pour mesurer les principaux paramètres biophysiques, physiologiquement pertinents. La plate-forme de puces à ADN cellulaire décrit ici se compose de quatre sections: la fabrication de substrats de polyacrylamide, la fabrication de tableaux, de la culture cellulaire et test de lecture et l&#39;analyse des données. VoirLa figure 1 pour un résumé schématique des trois premières sections expérimentales; voir la figure 2 pour un résumé schématique de la section finale avec un accent sur l&#39; analyse des données d&#39;immunofluorescence. Afin d&#39;adapter la plate - forme de puces à ADN de la cellule à l&#39; étude des interactions cellule-substrat biomécaniques, on a utilisé des substrats de Polyacrylamide du module d&#39;accordable jeune , mais une porosité similaire, par Wen et al. 41. Pour permettre des mesures TFM des forces exercées par les cellules sur leur substrat, nous avons implémenté un format de Petri plat à fond de verre en plus du microscope en verre épais coulisse fréquemment utilisé par d&#39;autres groupes. Ainsi, cette plate - forme de puces à ADN cellulaire est capable de mesures parallèles de la différenciation cellulaire par immunofluorescence sur des lames de microscope et les forces générées cellules par TFM sur la vaisselle à fond de verre séparés. Nous avons également appliqué plusieurs améliorations à l&#39;approche analytique utilisée avec des microréseaux cellulaires. Spécifiquesly, au lieu de paramétrique Z-score de l&#39;intensité globale de l&#39;île, nous mesurons l&#39;intensité à cellule unique et appliquer la normalisation quantile afin de tenir compte des distributions non-normales et décrire plus précisément le comportement cellulaire. Nous croyons que ces améliorations fournissent une utilité particulière vers les enquêtes sur les processus biologiques dans lesquels les signaux à la fois biochimiques et biophysiques jouent des rôles importants qui se croisent. En outre, nos améliorations analytiques permettent l&#39;application des microréseaux cellulaires à des études d&#39;une gamme de fonctions cellulaires pour lesquelles une seule cellule et de comportement au niveau de la population divergent.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microréseaux cellulaires microfabriqués, qui consistent en des combinaisons de biomolécules coordonnées imprimées sur une surface d&#39;hydrogel élastique, fournissent un système d&#39;ingénierie à haut débit étroitement contrôlé pour mesurer l&#39;impact des signaux biochimiques disposés sur la différenciation cellulaire. Les efforts récents utilisant des microréseaux cellulaires ont démontré leur utilité pour les études combinatoires dans lesquelles de nombreux facteurs microenvironnement sont présentés en parallèle. Cependant, ces efforts ont porté principalement sur l&#39;étude des effets des signaux biochimiques sur les réponses cellulaires. Ici, nous présentons une plate-forme de puces à ADN cellulaire avec les propriétés des matériaux accordables pour évaluer à la fois la différenciation des cellules par des interactions d&#39;immunofluorescence et de la cellule-substrat biomécanique par la force de traction microscopie. Pour ce faire, nous avons développé deux formats différents en utilisant des hydrogels de polyacrylamide de variation du module de Young fabriqué soit sur des lames de microscope ou des plats à fond de verre de Pétri. Nous fournissons bespratiques de t et le dépannage pour la fabrication de biopuces sur ces substrats d&#39;hydrogel, la culture cellulaire ultérieure sur microarrays, et l&#39;acquisition de données. Cette plate - forme est bien adaptée à une utilisation dans les enquêtes sur les processus biologiques pour lesquels les deux biochimique (par exemple, la composition de la matrice extracellulaire) et biophysique (par exemple, la rigidité du substrat) indices peuvent jouer significative, coupant les rôles.

L&#39; utilisation de cette plate - forme, nous avons étudié le rôle des deux indices biochimiques et biophysiques dans la spécification du sort des progéniteurs du foie 34, 35. / Notch G conjuguée à des ligands de protéine A ont amélioré la rétention et le regroupement dans l&#39;hydrogel de polyacrylamide (figure 3A) et sont en outre capables de différenciation des progéniteurs du foie conduisant vers une destinée des cellules des canaux biliaires (figure 3B). En utilisant une analyse à cellule unique, nous avons quantifié la réponse à des ligands Notch pour les protéines d&#39;ECM de collagène I, le collagène III, le collagène IV, la fibronectine et la laminine (figure 3C), estimant que la réponse des progéniteurs du foie au ligand dépend également de la contexte ECM. Enfin, nous avons utilisé shRNA knockdown pour générer progéniteurs du foie sans les ligands DLL1 et JAG1. La réponse au ligand de Notch revêtu variait en fonction de la prEsence soit un ligand, ce qui confirme que la réponse au ligand cellulaire extrinsèque est également fonction du ligand expression de cellule intrinsèque (figure 3D). De plus, nous avons observé une sous - population distincte de la double-positive (ALB + / OPN +) cellules dans le knockdown DLL1 (Figure 3D). Ensemble, ces résultats représentatifs montrent: (1) les capacités combinatoires du format de tableau, comme en témoigne l&#39;appariement de multiples protéines revêtu d&#39;ECM et des ligands Notch avec le knockdown de ligands individuels; (2) la fonctionnalité non seulement revêtit protéines ECM, mais aussi revêtit ligand cellule-cellule par l&#39;intermédiaire de la protéine A / G à médiation par conjugaison; et (3) la mise en œuvre de notre analyse unicellulaire et sa capacité à discerner les sous-populations uniques. Nous avons également observé que la différenciation des progéniteurs du foie dépend à la fois de la rigidité du substrat et la composition de l&#39; ECM (figure 4A </str<html> ong&gt;), trouver spécifiquement que le collagène IV est favorable à la différenciation des deux substrats souples et rigides alors que la fibronectine ne supporte que la différenciation sur des substrats rigides (figure 4B). Cartes de chaleur représentatifs de mesures TFM ont suggéré que le stress de traction soutenue à faible rigidité du substrat sur le collagène IV une différenciation dans les cellules des canaux biliaires (figure 4C), une constatation confirmée par des valeurs racine carrée moyenne moyenne (Figure 4D). Ensemble, ces résultats représentatifs montrent: (1) l&#39;intégration réussie de TFM avec des microréseaux de cellules sur des substrats avec une rigidité accordable pour évaluer à la fois le phénotype cellulaire et la contrainte de traction; (2) la coordination du sort de progéniteurs du foie à la fois avec la composition de matrice et la rigidité du substrat; et (3) la mise en œuvre de nos analyses et typiques profils de contraintes de traction TFM en microréseaux cellulaires. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Vue d&#39; ensemble schématique montrant les trois premières sections expérimentales. Dans la section 1, des substrats en verre sont nettoyés et silanisées pour faciliter la fabrication d&#39;hydrogels de polyacrylamide. Dans la section 2, les combinaisons de biomolécules d&#39;intérêt sont préparés dans une source microplaques 384 puits. Un arrayer robotique est ensuite chargé avec des épingles propres, la microplaque source, et les hydrogels de polyacrylamide et initialisée, la fabrication des tableaux sur les hydrogels. Dans la section 3, les cellules sont ensemencées sur des domaines disposés en réseau et on les laisse adhérer, après quoi le protocole de culture d&#39;intérêt est effectuée. Au point final, les cellules sont soit fixes pour immunocytochimie / immunofluorescence ou analysées en utilisant TFM. Les barres d&#39;échelle sont de 75 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> dans les pages = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figure 2: Traitement et analyse des données immunofluorescence de tableaux. (A) sol, composites 32 bits des images RVB sont d&#39; abord mis en cellule et ensuite divisé en différents canaux de 8 bits. En utilisant une combinaison de marqueurs fluorescents disposés et îlots de cellules, trois coins de la matrice sont identifiés pour permettre l&#39;orientation automatique et maillage des réseaux. (B) les données à l&#39; unité de cellules est généré pour chaque canal des tableaux d&#39;entrée. Afin de tenir compte de la dérive expérimentale, la normalisation quantile est appliquée par répliquée biologique, produisant une distribution unique partagée entre toutes les répétitions. Quantile données normalisées est ensuite tracée et interprétée par le calcul des mesures d&#39;ensemble (par exemple, les cellules / île, intensité moyenne, les cellules de pourcentage positives pour une étiquette) ou d&#39; analyse directe des distributions unicellulaires.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figure 3: Notch Ligand Présentation du foie Progéniteur Différenciation à titre de médiateur. (A) Fc recombinant Notch ligands Jagged-1 (JAG1) et Delta-like 1 (DLL1) présentaient une meilleure rétention et le regroupement lorsque revêtit avec de la protéine A / G. La barre d&#39;échelle est de 50 um. Progéniteurs (B) , du foie différenciées en cellules du canal cholédoque , sur présentation d&#39; un ligand Notch. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est un marqueur nucléaire, l&#39;albumine (ALB) est un marqueur cellulaire hépatique, et l&#39;ostéopontine (OPN) est un marqueur des cellules du canal cholédoque. La barre d&#39;échelle est de 150 um. (C) Quantification du pourcentage de cellules positives pour OPN pour les ligands de Notch JAG1, DLL1 et Delta-like 4 (DLL4) sur les protéines ECM collagène I, collagen III, le collagène IV, la fibronectine et la laminine. T Les -Tests de Student ont été effectuées contre le contrôle IgG pour chaque ligand Notch rangé dans chaque protéine ECM avec P-valeurs indiquées pour P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytométrie de ALB et OPN pour les cellules sur le collagène III présentées avec les ligands de Notch JAG1, DLL1 et DLL4. Progéniteurs hépatiques sans Notch ligands DLL1 et JAG1 (ie, shDll1 et shJag1) ont été générés en utilisant shRNA knockdown. Les données de (C) présentés sous forme de moyenne ± ETM Ce chiffre a été modifié à partir de Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figure 4: Matrix Composition et Substrat Rigidité Coordinate Liver Progéniteur Différenciation. (A) la différenciation hépatique progéniteurs biliaires cellules de canal dépend à la fois la composition de l&#39; ECM et la rigidité du substrat. DAPI est un marqueur nucléaire, ALB est un marqueur cellulaire hépatique, et OPN est un marqueur des cellules du canal cholédoque. (B) Quantification du pourcentage de cellules positives pour l&#39; OPN sur des substrats de module d&#39;Young 30 kPa, 13 kPa et 4 kPa pour le collagène I (C1), le collagène IV (C4), la fibronectine (FN), et toutes bidirectionnelles combinaisons de ces protéines de la MEC. (C) Contrainte de traction cellulaire dépend à la fois la rigidité du substrat et de la composition ECM. (D) Quantification des valeurs racine carrée moyenne de stress de traction sur des substrats de module de Young 30 kPa et 4 kPa pour le collagène I (C1), le collagène IV (C4), la fibronectine (FN), et toutes les combinaisons dans les deux sens de ceux protéines ECM. En (B) et (D), les données ont été présentées sous forme de moyenne ± t les -Tests de MEB et étudiantsont été réalisées contre 30 kPa pour chaque combinaison d&#39;ECM avec les valeurs P indiquées pour P &lt;0,05 (*) P &lt;0,01 (**), et P &lt;0,001 (***). Les barres d&#39;échelle sont de 50 um. Ce chiffre a été modifié depuis Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Section </td><td fo:width="1.5in"> Problème </td><td fo:width="1.5in"> Causes possibles </td><td> Solution </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabrication de polyacrylamide Substrat. </td><td> Coverglass ne peut pas être retiré de l&#39;hydrogel. </td><td> Surpolymérisation. </td><td> Réduire le temps de polymérisation à &lt;10 minutes (4 W / m 2). Vérifier que crossli UVsortie nker est à portée attendue. </td></tr><tr><td> Une mauvaise polymérisation d&#39;hydrogel de polyacrylamide. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Augmenter le temps de 10 minutes (&gt; 4 W / m 2) de polymérisation. Vérifiez que la sortie de réticulation UV est à portée attendue. </td></tr><tr><td> hydrogels polyacrylamide sont endommagés après le retrait de lamelle. </td><td> hydrogels de polyacrylamide souples sont faciles à endommager. </td><td> Nous observons rendement décroissant hydrogel de fabrication (~ 50%) pour le plus doux (soit 4 kPa) hydrogels en particulier. Manipuler hydrogels doucement et augmenter le nombre de départ pour atteindre le rendement souhaité. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Fabrication de tableaux. </td><td rowspan="2"> Pauvre ou incohérente morphologie du spot. </td><td> fonction de l&#39;humidificateur Incohérence. </td><td> Vérifier que l&#39;humidificateur et RHÉOMÈTRE fonctionnel tout au long de chaque cycle d&#39;impression et de maintenir 65% d&#39;humidité relative. </td></tr><tr><td> Pins coincé dans la tête d&#39;impression ou de sabotged. </td><td> Nettoyez la tête d&#39;impression pour permettre le mouvement de broche libre. broches Nettoyer soigneusement avant ou après chaque cycle d&#39;impression pour éliminer les agrégats de canaux de broches. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Culture cellulaire et test d&#39;exécution. </td><td rowspan="2"> détachement de la cellule ou de mort sur les tableaux après fixation initiale. </td><td> Sursemis et la prolifération excessive. </td><td> Réduire la densité de semis initiale et le temps. Utilisez &quot;maintenance&quot; ou &quot;différenciation&quot; des médias lors de la culture de réseau pour réduire la prolifération cellulaire. </td></tr><tr><td> Libération de toxique acrylamide monomère hydrogel. </td><td> Faire tremper les hydrogels dans dH 2 O pendant au moins 3 jours pour permettre la diffusion / libération de monomère d&#39;acrylamide et de réduire la toxicité cellulaire. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Les cellules ne fixent pas les tableaux. </td><td> -Ensemencement. </td><td> Augmenter la densité de semis initiale et le temps. Utilisez un type plus fortement adhérente de cellules. </td></tr><tr><td> Mauvais dépôt dela matrice ou de l&#39;état de biomolécules. </td><td> Repères propres des particules et des agrégats, confirment les paramètres d&#39;impression, et évaluer détachage des marqueurs fluorescents, par exemple, le dextrane conjugué à la rhodamine. </td></tr><tr><td> Spécificité des interactions cellule-matrice. </td><td> Différents types de cellules adhèrent spécifiquement à certains mais pas d&#39;autres protéines de la MEC. Testez plusieurs protéines ECM différentes avec vos cellules. </td></tr><tr><td> stockage réseau Suboptimal après fabrication. </td><td> Nous recommandons le stockage des tableaux fabriqués nuit à 65% d&#39;humidité relative et de la température ambiante, en partie pour éviter des changements de phase lors de la congélation. L&#39;adhésion cellulaire est sensible à la fois l&#39;humidité, la température et le temps de stockage; assurez-vous que ces paramètres sont compatibles / optimisé pour vos expériences. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Détachement d&#39;hydrogel à partir du substrat de verre au cours de la culture cellulaire. </td><td> Pauvre diapositive nettoyage et silanisation. </td><td> Remplacer les solutions de travail pour le nettoyage de diapositives etsilanisation. </td></tr><tr><td> hydrogel Overdehydrated. </td><td> Ne pas laisser hydrogels déshydratant sur une plaque chauffante pendant plus de 15-30 min. </td></tr><tr><td> 4. Analyse des données. </td><td> La forte variabilité entre les taches et les diapositives répliqués. </td><td> Variabilité dans le tableau de fabrication. </td><td> Vérifiez que les broches et les têtes d&#39;impression sont propres. Confirmer la fonction de l&#39;humidificateur. Visualiser et quantifier place et réseau de qualité en utilisant des marqueurs fluorescents. réseaux de magasins comme recommandé ci-dessus. </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Dépannage.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

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