Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
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Wir erkennen an Austin Cyphersmith und mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universität von Illinois in Urbana-Champaign) für die Unterstützung bei der Mikroskopie und für die großzügige Aufnahme von Bildschirm und Video-Capture in der Mikroskopie Kern.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In unseren Experimenten haben wir, dass die häufigste Defekt gefunden auf die Qualität der hergestellten Arrays verbunden sind und schlecht Reaktion im biologischen System von Interesse charakterisiert. Wir verweisen auf die Tabelle 1 für die gemeinsame Ausfallarten in Zellmikroarray - Experimenten und der damit verbundenen Schritte zur Fehlerbehebung. In Bezug auf die Qualität von Arrays insbesondere empfehlen wir folgendes. Bestätigen Sie die technische Qualität und Robustheit der Gruppierungs Programme, Parameter und Puffer fluoreszenzmarkierte Moleküle wie Rhodamin-konjugierten Dextran verwendet wird. Gründlich reinigen Stifte entweder vor oder nach dem Gruppierungs pro Anweisungen des Herstellers und weitere visuell zu überprüfen, dass die Stiftkanäle frei sind von Schutt mit einem Lichtmikroskop. Bestätigen Sie gruppierten Biomolekül Retention unter Verwendung der allgemeinen Protein Flecken oder Immunmarkierung. Man beachte , dass Biomoleküle mit einem Molekulargewicht unter 70 kDa sind, häufig nicht 23 in dem Hydrogel beibehalten </<html> sup&gt; 31. Validieren gruppierten Biomolekül Zell-Funktionalität mehrere Zelltypen verwendet. Beachten Sie, dass nur anhaftenden Zellen mit Arrays kompatibel sind; Zusätzlich Haftung auf Arrays hängt sowohl zellspezifischen Eigenschaften (zB Integrin - Expressionsprofil) und den ausgewählten ECM Proteine. Aufgrund des beschränkten Platz, haben wir nicht eine umfassende Behandlung von Array - Design, Layout und Fertigung hier und verweisen den Leser auf vorherigen 23 vorgesehen funktioniert, 25. Wir verwenden in der Regel 100 Spot Subarrays (150 &amp; mgr; m Fleckdurchmesser, 450 &amp; mgr; m von Mitte zu Mitte Abstand) , bestehend aus 10-20 einzigartigen Biomolekül Bedingungen (dh 5-10 Punkte / Zustand). Die Anzahl der Sub-Arrays in einem Array in Abhängigkeit von der Anzahl der Biomolekül Bedingungen von Interesse abhängig, die bequem bis zu einer 25 × 75 mm Objektträger bis 1.280 skaliert werden kann (~ 6.400 Spots in 64 Subarrays)xref &quot;&gt; 25, 31 Die Parameter weiter oben in Abhängigkeit von der Mustergröße von Interesse variieren;. Stifte in der Lage , Muster von 75 zu erzeugen - 450 &amp; mgr; m sind leicht verfügbar. Array-Experimente werden am besten durch die Validierung von High-Scoring angeordnet Bedingungen von Interesse unter Verwendung anderer Kulturformate, Assay Ablesungen ergänzt und biologische Modellsysteme. Insbesondere empfehlen wir weitere Effekte von ausgewählten Array - Bedingungen Validierung unter Verwendung von Massenkulturen in Verbindung mit molekularbiologischen Standardtechniken (zB qRT-PCR, Immunoblot) oder Standard - TFM. Genetische Manipulation (zB Zuschlags oder Überexpression) des Faktors von Interesse in einem geeigneten biologischen Modellsystem kann auch dazu dienen , Effekte in Arrays beobachtet , um zu bestätigen. In - vivo - Tiermodelle repräsentieren ein weiteres Mittel zur Validierung und wurden vor kurzem verwendet, zum Beispiel die zentrale Rolle von Galectin-3 und Galectin-8 in bestätigenmetastatischen Nische der Lungenkrebs, wie zunächst über Zellmikroarray identifiziert 31, 49. Eine Anzahl von anderen Verfahren verwendet wurden Mikroumgebungs Regulation von Zellfunktionen zu untersuchen, einschließlich einer Vielzahl von zweidimensionalen mikrofabrizierten Systeme 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 und dreidimensionale engineered Biomaterial Systeme 56, 57, 58 , 59, 60, 61. Im Vergleich mit anderen Verfahren, beschrieben die besonderen Vorteile der Zelle Microarray-Plattform hier bestehen aus: (1) einem Durchsatz von bis zuHunderte oder Tausende von unterschiedlichen Kombinationen von Faktoren, so dass Analyse Wechselwirkungen; (2) zugänglich, automatisierte Bildgebung und Analyse; (3) Integration der beiden biochemischen und biophysikalischen Ablesungen mit kontrollierter Darstellung von angeordneten Faktoren; (4) die Fähigkeit Substratmaterialeigenschaften zu variieren; und (5) High-Content-Single-Cell-Analyse von Zellschicksal und Funktion. Zusammenfassend ermöglicht die Kombination von Zell-Mikroarrays mit TFM auf Substraten von abstimmbaren Substrat Steifigkeit gründliche Charakterisierung der beiden biochemischen und biophysikalischen Signale. Wie hier dargestellt, ist diese Plattform generalizable und können leicht an eine Vielzahl von adhärenten Zelltypen und Gewebe Kontexten zu einem verbesserten Verständnis der kombinatorischen Mikroumgebungs Regulation der Zelldifferenzierung und Mechanotransduktion angewendet werden.

Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebungsfaktoren vermitteln eine Vielzahl von biologischen Prozessen während der Entwicklung, Homöostase und Pathogenese der Erkrankung 1, 2, 3, 4. Diese Mikroumgebungs Wechselwirkungen umfassen die Lieferung von löslichen Faktoren zu Zellen, Zell-Matrix-Bindung, und die Zell-Zell-Wechselwirkungen über Ligand-Rezeptor-Bindung. Zusätzlich zu den oben genannten biochemischen Überlegungen biophysikalischen Parameter, wie Substrat mechanischen Eigenschaften (beispielsweise Elastizitätsmodul, Porosität) und der Zellform und die damit verbundenen nachgeschalteten Mechanotransduktion zunehmend Anerkennung als wichtige Mediatoren der Zelldifferenzierung gewonnen haben , 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Die Signale aus diesen Mikroumgebungs Wechselwirkungen dienen als Eingänge für Gen-Netzwerke und Signalwege. Darüber hinaus sind diese Zellen intrinsische Komponenten bieten auch Rückmeldung an die Mikroumgebung über sekretierte Faktoren und Matrix-abbauende Enzyme, eine komplexe co-Regelungsschleife zwischen zell intrinsischen genetischen Programme und zell extrinsische Faktoren Mikroumgebungs 5, 11, 12 vervollständigt. Die Verwendung von technischen Systemen für die kontrollierte Darstellung von Mikroumgebungsfaktoren wurde in einer Reihe verschiedener Kontexte 13, 14, 15 bewährt. Mikrofabrizierte Systeme haben insbesondere präzise räumliche Strukturierung von Proteinen und Zellen erleichtert sowie hoch parallelisierte Analyse über Miniaturisierung 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Zelle Mikroarrays stellen eine solche mikrofabrizierten System , in dem Kombinationen von Biomolekülen sind berührungs gedruckt auf einem elastischen Polyacrylamidhydrogel Substrat 23, 24, 25. Die Einbeziehung von zellKlebstoffKomponenten (nämlich Matrixproteine) ermöglicht anhalt Zelladhäsion und Kultur auf Mikroarrays, die häufig durch nachgeschaltete Analyse mittels Immunzytochemie und fluoreszierende Reporter folgt. Zellmikroarrays wurden zur Verwirklichung eines verbesserten Verständnis von Leberzell - Phänotyp 23, 26, neurale Vorläufer Differenzierung 27, produktiv gerichtet Mammary Vorläufer Entscheidungen Schicksal 28, embryonalen Stammzellen Wartung / Differenzierung 23, 29, 30, Metastasen Lungenkrebs 31 und therapeutische Reaktion bei Melanom 32. Wir haben vor kurzem gezeigt , die Verwendung von Zell - Microarrays zur Bestimmung der Rolle der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinzusammensetzung in Endoderm Spezifikation 33, Lebervorläufer Differentiation 34, 35, und die Zelllungentumorarzneimittelantwort 36. In diesen Arbeiten haben wir uns auf die Erweiterung der kombinatorischen Fähigkeiten der Array-Plattform und die Erkundung der Kreuzungen von Zell-Eigen Signalisierung mit extrazellulären Matrixzusammensetzung und Biomechanik konzentriert. Darüber hinaus haben wir biophysikalischen Ablesungen in diesem Array Plattform implementiert quantitativ Eigenschafte, um die Möglichkeit zu bieten,zeichnen die Rolle der Zellkontraktilität in Differenzierungsprozessen 35. Dazu integriert wir Traktionskraftmikroskopie (TFM) mit Zellmicroarrays Hochdurchsatzbewertung von zell erzeugten Traktion zu ermöglichen. TFM ist ein weithin genutzt Verfahren zell erzeugten Zugkräfte zu messen und hat sich mit der Zusammensetzung und der Biomechanik des lokalen Mikro 37, 38, 39, 40 in Bezug auf die Koordinierung der einzelnen Zelle und Gewebe-Ebene Funktion wichtige Erkenntnisse zur Verfügung gestellt. Somit liefert für Meßtaste, physiologisch relevanten biophysikalischen Parameter eines Hochdurchsatzsystem mit Zellmicroarrays TFM kombiniert. Die Zelle Microarray-Plattform hier beschriebene besteht aus vier Abschnitten: Herstellung von Polyacrylamid-Substrate, die Herstellung von Arrays, Zellkultur und Assay Auslesung und Analyse von Daten. SehenFigur 1 eine schematische Zusammenfassung der ersten drei Versuchsabschnitte; siehe Abbildung 2 für eine schematische Zusammenfassung des letzten Abschnitts mit einem Schwerpunkt auf der Analyse von Immundaten. Um die Zelle Microarray - Plattform auf Studien von biomechanischen Zell-Substrat - Wechselwirkungen anzupassen, haben wir Polyacrylamid - Substrate von abstimmbaren Elastizitätsmodul , aber ähnliche Porosität, je Wen et al. 41. TFM Messungen der Kräfte, die durch Zellen, die auf ihrem Substrat ausgeübt zu ermöglichen, haben wir ein Glasboden-Petrischale Format neben dem dicken Glasobjektträgern durch andere Gruppen häufig genutzt. Somit ist diese Zelle Microarray Plattform, die parallel Messungen der Zelldifferenzierung mittels Immunofluoreszenz auf Objektträgern und zell erzeugten Kräfte über TFM auf separaten Glasbodenschalen. Wir haben auch eine Reihe von Verbesserungen an den analytischen Ansatz häufig verwendete mit Zellmikroarrays angewendet. specifically statt parametrischer Z-Scoring der gesamten Insel Intensität messen wir Intensität Einzelzelle und Quantil Normalisierung, um für Nicht-Normalverteilungen und genauer Zellverhalten beschreiben zu berücksichtigen gilt. Wir glauben, dass diese Verbesserungen einen besonderen Nutzen auf Untersuchungen von biologischen Prozessen schaffen, bei dem sowohl biochemische und biophysikalische Signale signifikant, sich schneidende Rollen spielen. Ferner ermöglichen es unseren analytischen Verbesserungen, um die Anwendung von Zellmikroarrays Studien einer Reihe von zellulären Funktionen, für die das Verhalten Einzelzelle und Bevölkerungsebene abweichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Mikrofabrizierten zelluläre Mikroarrays, welche der kontakt gedruckten Kombinationen von Biomolekülen auf einem elastischen Hydrogel Oberfläche bestehen, bieten eine streng kontrolliert, Hochdurchsatz-engineered System für den Einfluss von angeordneten biochemische Signale auf die Zelldifferenzierung zu messen. Die jüngsten Bemühungen der Zelle unter Verwendung von Microarrays haben ihre Nützlichkeit für kombinatorische Studien nachgewiesen, in denen viele Mikroumgebungsfaktoren sind parallel dargestellt. Allerdings haben diese Bemühungen konzentriert sich hauptsächlich auf die Auswirkungen der biochemischen Signale auf Zell-Reaktionen zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Zelle Microarray-Plattform mit abstimmbaren Materialeigenschaften für die Beurteilung sowohl der Zelldifferenzierung durch Immunofluoreszenz und biomechanische Zell-Substrat-Wechselwirkungen, die durch Traktion Kraftmikroskopie. Dazu haben wir zwei verschiedene Formate unter Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher Young-Modul entweder auf Mikroskop-Objektträger oder Glasboden-Petrischalen hergestellt entwickelt. Wir bieten BESt Praktiken und Problemlösungen für die Herstellung von Microarrays auf diesen Hydrogel-Substrate, die nachfolgende Zellkultur auf Mikroarrays, und der Übernahme von Daten. Diese Plattform ist gut geeignet für die Verwendung bei Untersuchungen der biologischen Prozesse , bei denen sowohl biochemische (beispielsweise extrazelluläre Matrixzusammensetzung) und biophysikalischen (beispielsweise Substrat Steifigkeit) cues signifikante spielen können, sich schneidende Rollen.

Mit dieser Plattform haben wir untersucht die Rolle der beiden biochemischen und biophysikalischen Signale in das Schicksal Spezifikation der Leber Vorläufern 34, 35. Protein A / G-konjugierten Notch - Liganden zeigten verbesserte Retention und clustering in dem Polyacrylamid - Hydrogel (3A) und waren weiterhin fähig ist zu einer Gallengang - Zellschicksal Differenzierung der Leber - Vorläufern Antriebs (3B). Verwendung von Einzelzellanalyse quantifiziert wir die Antwort auf die Notch - Liganden für die ECM - Proteine Kollagen I, Kollagen III, Kollagen IV, Fibronectin und Laminin (3C), Feststellung , dass die Antwort von Lebervorläuferzellen an den Liganden auch auf die hängt ECM Kontext. Zuletzt verwendeten wir shRNA Knockdown Leber Vorläufern ohne den Liganden DLL1 und JAG1 zu erzeugen. Die Reaktion auf die aufgereiht Notch-Liganden variiert in Abhängigkeit von der prEsence von beiden Liganden zu bestätigen, dass die Reaktionsfähigkeit der Zell extrinsischen Liganden ist auch eine Funktion des Zell intrinsischen Liganden - Expression (Abbildung 3D). Ferner beobachteten wir eine deutliche Subpopulation von doppelt positiven (ALB + / OPN +) Zellen im DLL1 Knockdown (3D). Zusammen zeigen diese repräsentative Ergebnisse: (1) die kombinatorischen Fähigkeiten des Array-Format, wie es durch die Paarung von mehreren aufgereiht ECM Proteine ​​und Notch-Liganden mit Zuschlags einzelner Liganden veranschaulicht; (2) die Funktionalität nicht nur angeordnet Proteine ​​ECM, sondern auch Zell-Zell-Liganden mittels Protein A / G-vermittelte Konjugation angeordnet sind; und (3) die Umsetzung unserer Single-Cell-Analyse und seine Fähigkeit, einzigartige Subpopulationen zu erkennen. Wir beobachteten auch , dass die Differenzierung der Leber - Vorläufern ist sowohl abhängig von der Substrat Steifigkeit und der ECM - Zusammensetzung (4A </str<html> Ong&gt;), ist , dass Kollagen IV speziell der Suche nach nur der Differenzierung unterstützend auf beiden weichen und steifen Substraten während Fibronektin Differenzierung auf steife Substrate (4B) unterstützt. Repräsentative Wärme Karten von TFM Messungen vorgeschlagen , dass nachhaltige Zugspannung bei niedrigen Substratsteifigkeit auf Kollagen IV Differenzierung in den Gallengang - Zellen (4C) gefördert, die Feststellung bestätigt durch das durchschnittliche Effektivwert-Quadrat - Werte (4D). Zusammen zeigen diese repräsentative Ergebnisse: (1) die erfolgreiche Integration von TFM mit Zellmikroarrays auf Substraten mit einer abstimmbaren Steifigkeit sowohl die Zell-Phänotyp und die Traktion Stress zu bewerten; (2) die Koordination der Lebervorläuferzellschicksal sowohl mit der Matrix-Zusammensetzung und dem Substrat Steifigkeit; und (3) die Umsetzung unserer TFM Analyse und typische Traktionsspannungsprofile in Zellmikroarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Schematische Übersicht der ersten drei Versuchsteilen angezeigt. In Abschnitt 1 werden Glassubstrate gereinigt und silanisiert die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogele zu erleichtern. In Abschnitt 2 werden die Biomolekül Kombinationen von Interesse in einer Quelle Mikrotiterplatte mit 384 gut vorbereitet. Ein Roboter-Arrayers wird dann mit sauberen Nadeln, die Quelle Mikrotiterplatte und die Polyacrylamid-Hydrogele und initialisiert, Herstellung Arrays auf den Hydrogelen geladen. In Abschnitt 3 werden die Zellen auf die Array-Domänen ausgesät und haften gelassen, wonach das Kulturprotokoll von Interesse durchgeführt wird. Am Endpunkt werden die Zellen entweder für Immunzytochemie / Immunofluoreszenz analysiert feste oder TFM verwenden. Maßstabsbalken sind 75 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> innerhalb-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Abbildung 2: Verarbeitung und Analyse von Immunfluoreszenz - Daten aus Arrays. (A) Fliesen-, Composite - 32-Bit - RGB - Bilder werden zuerst binned und dann aufgeteilt in einzelne 8-Bit - Kanäle. Verwendung einer Kombination von angeordneten fluoreszierenden Marker und Zellinseln, drei Ecken des Arrays identifiziert für die automatische Ausrichtung und Rasterung der Arrays zu ermöglichen. (B) Einzelzellendaten für jeden Kanal der eingegebenen Arrays erzeugt. Um für experimentelle Drift zu berücksichtigen, wird Quantils Normalisierung durch biologische Replikation angewendet, um eine Shared Verteilung über alle Replikate zu erzeugen. Quantile normalisierten Daten werden anschließend über die Berechnung der Ensemblemessungen (zB Zellen / Insel, mittlere Intensität, Prozent Zellen positiv für ein Label) oder direkte Analyse von Einzelzellverteilungen aufgetragen und interpretiert.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Abbildung 3: Notch - Liganden Präsentation Vermittelt Leber Progenitor Differenzierung. (A) Fc-rekombinante Notch - Liganden Jagged-1 (JAG1) und Delta-like 1 (DLL1) zeigten verbesserte Retention und Clustering , wenn sie mit Protein A / G angeordnet. Maßstabsbalken ist 50 &amp; mgr; m. (B) Leber Vorläufern differenziert in den Gallengang - Zellen bei Vorlage mit Notch - Liganden. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) ist ein Kern Etikett, Albumin (ALB) ein Leberzellmarker ist, und Osteopontin (OPN) ist eine Gallengang-Zellmarker. Maßstabsbalken ist 150 &amp; mgr; m. (C) Quantifizierung der Prozentsatz der Zellen , die positiv für OPN für den Notch - Liganden JAG1, DLL1 und Delta-like 4 (DLL4) auf die ECM - Proteine Kollagen I, collagen III, Kollagen IV, Fibronectin und Laminin. Student-t -Tests wurden für jede aufgereiht Notch - Liganden gegen Kontroll - IgG durchgeführt innerhalb jedes ECM - Proteins mit P-Werte angegeben für P &lt;0,05 (*). (D) Imaging - Zytometrie von ALB und OPN für Zellen auf Kollagen III mit den Notch - Liganden präsentiert JAG1, DLL1 und DLL4. Leber - Vorläufern ohne die Notch - Liganden DLL1 und JAG1 (dh shDll1 und shJag1) wurden shRNA Knockdown generiert. Daten in (C) dargestellt als Mittelwert ± SEM Diese Zahl wurde von Kaylan et al modifiziert. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Abbildung 4: Matrixzusammensetzung und Substrat Stiffness Coordinate Leber Progenitor Differenzierung. (A) Differenzierung Liver Vorläuferzellen zu Gallenkanal ist abhängig von sowohl ECM - Zusammensetzung und dem Substrat Steifigkeit. DAPI ist ein Kern Etikett ist ALB eine Leberzellmarker und OPN ist ein Kanalzellmarker Galle. (B) Quantifizierung der Prozentsatz der Zellen positiv für OPN auf Substraten des Elastizitätsmoduls 30 kPa, 13 kPa, und 4 kPa für Kollagen I (C1), Kollagen IV (C4), Fibronectin (FN), und alle Zwei-Wege - Kombinationen diese ECM-Proteine. (C) Zell Zug beansprucht wird sowohl Substrat Steifigkeit und ECM - Zusammensetzung abhängig. (D) Die Quantifizierung der root-mean-square Werte der Zugspannung auf Substraten des Elastizitätsmoduls 30 kPa und 4 kPa für Kollagen I (C1), Kollagen IV (C4), Fibronektin (FN) und alle Zwei-Wege - Kombinationen derjenigen ECM-Proteine. In (B) und (D) wurden die Daten als Mittelwert ± SEM und Student t -Tests präsentiertfür jede ECM Kombination mit P-Werten gegenüber 30 kPa wurden für P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) und P &lt;0,001 (***) angegeben durchgeführt. Maßstabsbalken sind 50 &amp; mgr; m. Diese Zahl wurde von Kourouklis et al modifiziert. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Abschnitt </td><td fo:width="1.5in"> Problem </td><td fo:width="1.5in"> Mögliche Ursachen </td><td> Lösung </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Herstellung von Polyacrylamid-Substrat. </td><td> Abdeckglas nicht aus Hydrogel entfernt werden. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reduzieren Polymerisationszeit auf &lt;10 Minuten (4 W / m 2). Überprüfen Sie, dass UV-crosslinker Ausgang ist im erwarteten Bereich. </td></tr><tr><td> Schlechte Polyacrylamid-Hydrogel-Polymerisation. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Erhöhen Polymerisationszeit auf&gt; 10 Minuten (4 W / m 2). Überprüfen Sie, dass UV-Vernetzer Ausgang innerhalb des erwarteten Bereichs liegt. </td></tr><tr><td> Polyacrylamide Hydrogele werden nach Entfernung der beschädigten Abdeckglas. </td><td> Soft-Polyacrylamid-Hydrogele sind leicht zu beschädigen. </td><td> Wir beobachten Abnahme Hydrogel Fertigungsausbeute (~ 50%) für den weichsten (dh 4 kPa) Hydrogele im Besonderen. Griff Hydrogele sanft und Startnummern erhöhen, um die gewünschte Ausbeute zu erreichen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Herstellung von Arrays. </td><td rowspan="2"> Schlechte oder inkonsistent Stelle Morphologie. </td><td> Uneinheitliche Luftbefeuchter Funktion. </td><td> Überprüfen Sie, dass Luftbefeuchter und Rheometer eine funktionelle während jeder Auflage und 65% relativer Feuchtigkeit halten. </td></tr><tr><td> Pins stecken in Druckkopf oder Clogged. </td><td> Reinigen Sie den Druckkopf kostenlos Stift Bewegung zu ermöglichen. Saubere Stifte gründlich vor oder nach jedem Drucklauf Aggregate von Stiftkanälen zu entfernen. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Zellkultur und Execution-Assay. </td><td rowspan="2"> Zellablösung oder Tod auf Arrays nach der ersten Anlage. </td><td> Nachsaat und übermäßige Vermehrung. </td><td> Reduzieren anfängliche Aussaatdichte und Zeit. Verwenden Sie &quot;Wartung&quot; oder &quot;Differenzierung&quot; Medien während Array Kultur Zellproliferation zu reduzieren. </td></tr><tr><td> Freisetzung toxischer Acrylamidmonomer aus Hydrogel. </td><td> Einweichen Hydrogele in dH 2 O für mindestens 3 d für die Diffusion / Freisetzung von Acrylamidmonomer zu ermöglichen und Zelltoxizität reduzieren. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Die Zellen nicht legen zu Arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Erhöhen anfängliche Aussaatdichte und Zeit. Verwenden Sie eine stärker adhärenten Zelltyp. </td></tr><tr><td> Schlechte Ablagerung vonMatrix oder Biomolekül Zustand. </td><td> Saubere Stifte und Aggregate, Druckparameter bestätigen und zu bewerten Spotten von Fluoreszenzmarkern, zB Rhodamin-konjugierten Dextran. </td></tr><tr><td> Spezifität der Zell-Matrix-Wechselwirkungen. </td><td> Verschiedene Zelltypen haften spezifisch an einige, aber nicht andere ECM-Proteine. Testen Sie mehrere verschiedene ECM-Proteine ​​mit Ihren Zellen. </td></tr><tr><td> Suboptimale Array Lagerung nach der Herstellung. </td><td> Wir empfehlen über Nacht bei 65% relativer Luftfeuchtigkeit und Raumtemperatur hergestellten Arrays speichern, teilweise Phasenänderungen zu vermeiden, während des Einfrierens. Zelladhäsion ist empfindlich gegenüber sowohl Feuchtigkeit, Temperatur und Lagerzeit; sicherstellen, dass diese Parameter für Ihre Experimente konsistent / optimiert sind. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Detachment von Hydrogel aus Glassubstrat während der Zellkultur. </td><td> Schlechte Rutsche Reinigung und Silanisierung. </td><td> Ersetzen Arbeitslösungen für Dia-Reinigung undSilanisierung. </td></tr><tr><td> Overdehydrated Hydrogel. </td><td> Lassen Sie keine Hydrogele auf einer heißen Platte länger als 15-30 Minuten auszutrocknen. </td></tr><tr><td> 4. Analyse der Daten. </td><td> Hohe Variabilität zwischen Replikat Flecken und Dias. </td><td> Variability in der Arrayherstellung. </td><td> Überprüfen Sie, ob Stifte und Druckkopf sauber sind. Bestätigen Luftbefeuchter Funktion. Visualisieren und zu quantifizieren Stelle und Array Qualität unter Verwendung von fluoreszierenden Markern. Shop-Arrays, wie oben empfohlen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fehlerbehebung.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

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Research

JoVE Journal

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