Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

אנו מכירים אוסטין Cyphersmith ו Mayandi Sivaguru (קרל ר Woese המכון לביולוגיה הגנום, אוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה עבור אדיב מסך בנדיבות לכידת וידאו בליבה מיקרוסקופיה.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בניסויים שלנו, מצאנו כי הכשלים הנפוצים ביותר קשורים לאיכות מערכים מפוברקים גרוע מאופיין תגובה במערכת הביולוגית של עניין. אנו מפנים את קורא טבלת 1 עבור מצבי כישלון משותפים בניסויי microarray תא שלבי פתרון קשורים. לגבי איכות מערכים בפרט, אנו ממליצים על הבאה. אשר את האיכות הטכנית וביציבות של עֲרִיכָה תוכניות, פרמטרים או מאגר באמצעות מולקולות שכותרתו fluorescently כגון dextran rhodamine מצומדות. לנקות ביסודיות סיכות לפני או אחרי עֲרִיכָה לפי הוראות היצרן ובהמשך לבדוק חזותי שערוצי הסיכה ברורים של פסולת באמצעות מיקרוסקופ אור. אשר שמירת biomolecule ערוכה באמצעות כתמי חלבון כלליים או immunolabeling. שים לב ביומולקולות עם משקל מולקולרי מתחת ל -70 kDa אינן נשמרות לעתים קרובות הידרוג&#39;ל 23, </<html> sup&gt; 31. אמת תא-פונקציונלי biomolecule ערוך באמצעות סוגי תאים מרובים. שים לב, רק תאים חסידים תואמי מערכים; בנוסף, הדבקה למערכים תלויים הוא תכונות התא ספציפי (למשל, פרופיל ביטוי integrin) ואת חלבוני ECM שנבחרו. עקב מספר המקומות המוגבל, לא סיפקנו טיפול רחב בעיצוב המערך, פריסה, ייצור פה מפנים את הקורא הקודם עובד 23, 25. אנו משתמשים בדרך כלל 100 subarrays ספוט (150 מיקרומטר קוטר נקודה, 450 מיקרומטר מרכז אל מרכז מרחק) מורכבים 10-20 תנאי biomolecule ייחודיים (כלומר, 5-10 כתמים / מצב). מספר subarrays במערך אחד משתנה בהתאם למספר תנאים biomolecule של עניין, אשר וניתן לשנותם בנוחות עד 1,280 בשקופית מיקרוסקופ אחד 25 × 75 מ&quot;מ (~ 6,400 נקודות ב -64 subarrays)Xref &quot;&gt; 25, 31 הפרמטרים לעיל ישתנו נוספים בהתאם לדפוס הגודל של עניין;. סיכות מסוגלות לייצר דפוסי 75 - 450 מיקרומטר זמינים. ניסויי מערך משלימים הטובים ביותר על ידי מתן תוקף תנאים ערוכים שקבלו דירוג הגבוה של עניין באמצעות פורמטי תרבות אחרים, readouts assay, ומערכות מודל ביולוגיות. באופן ספציפי, אנו ממליצים נוספים אימות השפעות של תנאים ערוכים בוחרים בתרביות בתפזורת בשילוב עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (למשל, qRT-PCR, immunoblotting) או תקן TFM. מניפולציה גנטית (למשל, מציאה או ביטוי יתר) של הגורם של עניין מערכת מודל ביולוגית מתאימה יכול לשמש גם כדי לאשר השפעות שנצפו במערכים. בשנת vivo במודלים של בעלי חיים לייצג פירושו אחר של אימות ושימשו לאחרונה, למשל, כדי לאשר את תפקידה המרכזי של galectin-3 ו galectin-8סרטן ריאות נישה גרורתי, כמו בתחילה זיהה באמצעות תא microarray 31, 49. מספר שיטות אחרות שמשו לחקור תקנת microenvironmental של תפקודים תאיים, כוללים מגוון רחב של דו ממדי מערכות microfabricated 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ו מערכות ביולוגיות מהונדסות תלת ממדי 56, 57, 58 59,, 60, 61. בהשוואה לשיטות אחרות, היתרונות המסוימים של פלטפורמת microarray תא המתואר כאן כוללים: (1) תפוקה עדמאה או אלף שילובים שונים של גורמים, המאפשרים ניתוח של השפעות אינטראקציה; (2) נגישה, הדמיה אוטומטית וניתוח; (3) שילוב של שניהם readouts ביוכימיות biophysical עם המצגת מבוקרת של גורמים ערוכים; (4) יכולת להשתנות תכונות חומר מצע; ו (5) ניתוח של גורל ותפקוד תא תא בודד גבוה תוכן. לסיכום, שילוב של microarrays תא עם TFM על מצעים של קשיחות המצע מתכונן מאפשרת אפיון מעמיק של שני רמזים ביוכימיים biophysical. כפי שהוצג כאן, פלטפורמה זו היא להכליל וניתן ליישום בקלות למגוון של סוגי תאים חסידים והקשרי רקמות לקראת הבנה טובה יותר של רגולצית microenvironmental קומבינטורית של התמיינות תאי mechanotransduction.

אינטראקציות בין תאים וגורמים microenvironmental שמסביב לתווך מגוון גדול של תהליכים ביולוגיים במהלך ההתפתחות, הומאוסטזיס, ומחלות בפתוגנזה 1, 2, 3, 4. אינטראקציות microenvironmental אלה כוללים משלוח של גורמים מסיסים לתאים, תא-מטריצה ​​מחייבת, ואינטראקציות תאי תאים באמצעות קולטן ליגנד המחייב. בנוסף לשיקולים ביוכימיים לעיל, פרמטרים biophysical, כגון תכונות מכניות המצע (למשל, מודולוס של יאנג, נקבוביות) ואת צורת התא, ואת mechanotransduction במורד הזרם הקשורים ויותר זכו להכרה כמתווכים המפתח של התמיינות תאים 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. אותות כתוצאה מאינטראקציות microenvironmental הללו משרתים כתשומות לרשתות גני מסלולי איתות. יתר על כן, מרכיבי תא-מהותי אלה גם ולספק משוב על המיקרו-הסביבה באמצעות גורמי מופרשים ואנזימים משפילים-מטריקס, השלימו לולאת שיתוף רגולטוריות מורכבת בין תכנות גנטי מהותי תאים וגורמים microenvironmental חיצוני תאי 5, 11, 12. השימוש במערכות מהונדסות עבור המצגת המבוקרת של גורמי microenvironmental הוכיח שימושי במגוון של קשרים שונים 13, 14, 15. מערכות microfabricated בפרט הקלו דפוסים מרחביים מדויקים של חלבונים בתאים וכן ניתוח parallelized ביותר באמצעות מזעור 13, <supclass = &quot;Xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays תא לייצג מערכת microfabricated אחד כזה שבו שילובים של מולקולות ביולוגיות הם מודפס קשר על מצע הידרוג&#39;ל polyacrylamide אלסטי 23, 24, 25. הכללת רכיבים דבק תאים (כלומר חלבונים מטריקס) מאפשרת הידבקות התא מתמשכת והתרבות על microarrays, אשר מלווה לעתים קרובות על ידי ניתוח במורד הזרם באמצעות immunocytochemistry וכתבים ניאון. Microarrays התא הופנה פרודוקטיבית להשגת הבנה משופרת של פנוטיפ כבד תא 23, 26, בידול עצבי מבשר 27, mammarהחלטות גורל אב y 28, / תחזוקת תאי גזע עוברי בידול 23, 29, 30, גרורות סרטן ריאות 31, ותגובה טיפולית מלנומה 32. אנחנו הוכחנו את השימוש לאחרונה של microarrays תא להגדרת התפקיד של תאי מטריקס (ECM) רכב חלבון במפרט endoderm 33, בידול ובתאים בכבד 34, 35, ותגובת תרופת תא ריאת גידול 36. בעבודות אלה, התמקדנו הרחבת היכולות קומבינטורית של פלטפורמת מערך לחקור את הצמתים של איתות תאי-מהותי עם הרכב תאי מטריקס ו ביומכניקה. בנוסף, יישמנו readouts biophysical במצע מערך זה כדי לספק את היכולת charac כמותיתterize את התפקיד של התכווצות תא בידול מעבד 35. לשם כך, אנו משולבים מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) עם microarrays התא לאפשר הערכת תפוקה גבוהה של מתיחת תא שנוצר. TFM היא שיטה שימוש נרחב למדוד כוחות המתיחה שנוצר התא סיפקה תובנות משמעותיות ביחס לתיאום פונקציה חד תאים ורקמות ברמה להרכב ביומכניקה של microenvironment המקומית 37, 38, 39, 40. לפיכך, שילוב TFM עם microarrays התא מספק מערכת תפוקה גבוהה למדידת מפתח, פרמטרי biophysical רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. פלטפורמת microarray התא המתואר כאן מורכבת מארבעה חלקים: המצאה של מצעי polyacrylamide, ייצור של מערכים, תרבית תאי הודעת assay, וניתוח של נתונים. לִרְאוֹתאיור 1 עבור סיכום סכמטי של השלושה הסעיפים הניסיוניים הראשונים; ראה איור 2 עבור סיכום סכמטי של הקטע האחרון עם דגש על ניתוח נתוני immunofluorescence. על מנת להתאים את פלטפורמת microarray תא המחקרים של אינטראקציות תא-מצע ביומכנית, השתמשנו מצעי polyacrylamide של מודולוס של יאנג מתכונן אבל נקבובי דומה, לכל אל וון et. 41. כדי לאפשר מדידות TFM של כוחות המופעלים על ידי התאים על המצע שלהם, יישמנו בפורמט צלחת זכוכית התחתונה פטרי בנוסף מיקרוסקופ זכוכית עבה שקופיות מנוצל לעתים קרובות על ידי קבוצות אחרות. לפיכך, פלטפורמת microarray התא הזה מסוגלת מדידות מקבילות של התמיינות תאים באמצעות immunofluorescence בשקופיות מיקרוסקופ וכוחות שנוצרו תא באמצעות TFM על מנות זכוכית תחתונה נפרדות. גם יש לנו ליישם מספר שיפורים על הגישה האנליטית נפוצה עם microarrays תא. specifically, במקום Z-ניקוד פרמטרית של עוצמת אי ברמה כללית אנו מודדים את עוצמת תא בודד ולהחיל נורמליזציה בחמישון כדי לתת דין וחשבון על הפצות הלא נורמליות יותר לתאר במדויק התנהגות הסלולר. אנו מאמינים שיפורים אלה מספקים כלי מסוים כלפי חקירות של תהליכים ביולוגיים שבהם שני רמזים ביוכימיים biophysical לשחק משמעותיים, תפקידים מצטלבים. יתר על כן, שיפורים האנליטית שלנו לאפשר יישום של microarrays תא ללימודים של מגוון רחב של תפקודים תאיים עבורו תא בודד והתנהגות ברמת האוכלוסייה לסטות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microarrays הסלולר microfabricated, הכוללות שילובים מודפס קשר של ביומולקולות על משטח הידרוג&#39;ל אלסטי, לספק נתונים לפיקוח הדוק, מערכת מהונדסים תפוקה גבוהה למדידת ההשפעה של אותות ביוכימיים ערוכים על התמיינות תאים. מאמצים אחרונים באמצעות מערכי תא הוכיחו השירות שלהם ללימודי קומבינטורית שבה גורמים רבים microenvironmental מוצגים במקביל. עם זאת, מאמצים אלה התמקדו בעיקר שבדקו את ההשפעה של רמזי ביוכימיים על תגובות תא. כאן, אנו מציגים פלטפורמת microarray תא עם תכונות חומר מתכוננות להערכה היא התמיינות התאים על ידי immunofluorescence ואינטראקציות תא-מצע ביומכנית ידי מיקרוסקופ כוח המתיחה. לשם כך, פיתחנו שני פורמטים שונים ניצול הידרוג polyacrylamide משתנה מודול יאנג מפוברק משני שקופיות מיקרוסקופ או צלחות פטרי זכוכית התחתונה. אנו מספקים BESשיטות t ופתרון בעיות עבור ייצור של microarrays על מצעים הידרוג&#39;ל אלה, תרבית תאים עוקבות על microarrays, ורכישת נתונים. פלטפורמה זו היא מתאימה היטב לשימוש בחקירות של תהליכים ביולוגיים עבורו הוא ביוכימיים (למשל, רכב תאי מטריקס) ו biophysical (למשל, קשיחות מצע) רמזים עשויים לשחק משמעותיים, מצטלבים תפקידים.

באמצעות פלטפורמה זו, חקרנו את תפקיד שני הרמזים ביוכימיים biophysical במפרט גורל האבות כבדים 34, 35. חלבון / הליגנדים Notch G מצומדות הראה שימור אשכולות משופר הידרוג&#39;ל polyacrylamide (איור 3 א) והיו יתר מצליח להבריח והתמיינות של אבות הכבד לקראת גורל התא צינור המרה (איור 3B). שימוש בניתוח תא בודד, אנו לכמת התגובה הליגנדים Notch עבור חלבוני ECM לי קולגן, קולגן III, IV קולגן, פיברונקטין, ו laminin (איור 3 ג), מציאת שהתגובה של אבות כבדים ליגנד תלוי גם על בהקשר ECM. לאחרונה, השתמשנו מציאת shRNA ליצור אבות כבדים ללא הליגנדים Dll1 ו Jag1. התגובה ליגנד Notch הערוך השתנתה בהתאם presence של או ליגנד, המאשר כי היענות ליגנד תאים חיצוניים היא גם פונקציה של הביטוי ליגנד-מהותי התא (איור 3D). יתר על כן, צפינו subpopulation מובהק של פעמים חיוביות (ALB + / OPN +) תאי מציאת Dll1 (האיור 3D). יחד, תוצאות הנציגים הללו מראים: (1) את היכולות קומבינטורית של פורמט המערך, כפי שהודגם על ידי הזיווג של חלבוני ECM ו- הליגנדים Notch ערוכים מרובים עם המציאה של הליגנדים פרט; (2) את הפונקציונליות של לא רק ערוכי חלבוני ECM אך ערוכה גם ליגנד תאי תאים באמצעות חלבון A / G בתיווך נטייה; ו (3) היישום של ניתוח התא הבודד שלנו ועל יכולתה להבחין בתת אוכלוסיות ייחודיות. אנו הבחנו גם כי הבידול של אבות כבדים תלוי הוא על קשיחות המצע ואת רכב ECM (איור 4 א </str<html> אונג&gt;), במיוחד במציאה כי קולגן IV תומכת בידול משני מצעים רכים ונוקשים ואילו פיברונקטין תומך רק בידול על מצעים נוקשים (האיור 4B). מפות חום נציג של מדידות TFM הציעו מתח מתיחה מתמשך לקראת קשיחות מצע נמוכה על קולגן IV קדם בידול לתאי צינור מרה (איור 4C), ממצא אושר על ידי ערכי שורש ממוצעים מרובע ממוצע (איור 4D). יחד, תוצאות הנציגים הללו מראים: (1) שילוב המוצלח של TFM עם microarrays תא על מצעים עם קשיחות מתכוננת להעריך הוא את פנוטיפ תא ואת לחץ המתיחה; (2) התיאום של גורל התא כבד ובתאים בשני רכב מטריקס קשיחות המצע; ו (3) היישום של ניתוח TFM שלנו ופרופילי מתח מתיחה טיפוסיים microarrays תא. <html> e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55,362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: הסקירה הכללית סכמטי המציג שלושת הסעיפים הניסיוניים הראשונים. בסעיף 1, מצעי זכוכית מנקים silanized כדי להקל על ייצור של הידרוג polyacrylamide. בסעיף 2, שילובי biomolecule של עניין ערוכים בתוך microplate מקור 384 גם. Arrayer רובוטית נטען אז עם סיכות נקי, microplate המקור, ואת הידרוג polyacrylamide ו אותחל, בודה מערכים על הידרוג&#39;ל. בסעיף 3, תאים הם זורעים על התחומים הערוכים ואפשרו לדבוק, שלאחריו פרוטוקול התרבות של ריבית מבוצע. בנקודת הקצה, תאים מקובעים או עבור immunocytochemistry / immunofluorescence או נותחו באמצעות TFM. ברי סולם הם 75 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> איור 2: עיבוד וניתוח של נתונים Immunofluorescence מ מערכים. (א) שיש, 32 סיבי מרוכבי תמונות RGB הם זרקו לפח ראשון ולאחר מכן התפצלו לערוצי 8 סיביים בודדים. באמצעות שילוב של סמני ניאון ערוכים ואיי תא, שלוש פינות של המערך מזוהות על מנת לאפשר התמצאות אוטומטית gridding של המערכים. (ב) נתוני תא יחיד מופקים עבור כל ערוץ של מערכי הקלט. על מנת לתת דין וחשבון על להיסחף ניסיוני, הנורמליזציה בחמישון מוחלת על ידי לשכפל ביולוגי, הפקת הפצה משותפת אחת בכל המשכפל. הנתונים מנורמלים Quantile מכן הוא זמם ולפרש באמצעות חישוב מדידות הרכב (למשל, תאים / אי, אומרים עצמה, תאי אחוז חיוביים עבור תווית) או ניתוח ישיר של הפצות תא בודד.מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 55,362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> איור 3: בידול ובתאים כבד מתווכת מצגת Notch ליגנד. (א) Notch Fc-רקומביננטי הליגנדים Jagged-1 (JAG1) ודלתא דמוי 1 (DLL1) הציג השמירה משופרת אשכולות כאשר ערוכים עם חלבון / G. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. (ב) אבות כבדים מובחנים לתוך תאי צינור המרה בהצגה עם ליגנד Notch. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוא תווית גרעינית, אלבומין (ALB) היא סמן תא בכבד ואי osteopontin (OPN) הוא סמן תא צינור מרה. בר סולם הוא 150 מיקרומטר. (C) כימות אחוז התאים החיוביים עבור OPN עבור הליגנדים Notch JAG1, DLL1, ודלתא דמוי 4 (DLL4) על חלבונים ECM קולגן אני, גollagen III, קולגן IV, פיברונקטין, ו laminin. -tests T של הסטודנט בוצע נגד IgG המלא לכל ליגנד Notch ערוך בתוך כל חלבון ECM עם ערכי P מותווה P &lt;0.05 (*). (ד) הדמיה cytometry של ALB ו OPN עבור תאים על קולגן III בפניך את הליגנדים Notch JAG1, DLL1, ו DLL4. אבות כבדים ללא Notch הליגנדים Dll1 ו Jag1 (כלומר, shDll1 ו shJag1) שהופקו באמצעות מציאת shRNA. הנתונים (C) כפי שהוצגו ממוצע ± SEM נתון זה יש הבדל בין Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> איור 4: רכב מטריקס ואת המצע הנוקש Coordinate בידול ובתאים כבד. (א) בידול ובתאים כבדים למרר תאי צינור תלוי הוא בהרכב ECM וקשיחות מצע. DAPI הוא תווית גרעינית, ALB הוא סמן תא בכבד ואי OPN הוא סמן תא צינור מרה. (ב) כימות של אחוז התאים החיוביים עבור OPN על מצעים של מודולוס של יאנג 30 kPa, 13 kPa, ו -4 kPa עבור קולגן אני (C1), קולגן IV (C4), פיברונקטין (FN), וכל דו כיוונית שילובים של אלה חלבוני ECM. (C) תא מתיחת לחץ תלוי הוא קשיחות מצע ורכב ECM. (ד) כימות של ערכים שורש ממוצע מרובע של מתח המתיחה על מצעים של מודולוס של יאנג 30 kPa ו -4 kPa עבור קולגן אני (C1), קולגן IV (C4), פיברונקטין (FN), וכל שילובים דו כיוונית של אלה חלבוני ECM. ב (ב) ו- (ד), הוצגו הנתונים כממוצע ± -tests t של SEM and Studentבוצעו נגד 30 kPa לכל צירוף ECM עם ערכי P מותווה P &lt;0.05 (*), P &lt;0.01 (**), ו- P &lt;0.001 (***). ברי סולם הם 50 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> סָעִיף </td><td fo:width="1.5in"> בְּעָיָה </td><td fo:width="1.5in"> סיבות אפשריות </td><td> פִּתָרוֹן </td></tr><tr><td rowspan="3"> ייצור 1. polyacrylamide המצע. </td><td> Coverglass לא ניתן להסיר הידרוג&#39;ל. </td><td> Overpolymerization. </td><td> מנמיכים פילמור זמן &lt;10 דקות (4 W / m 2). בדוק UV crossliפלט nker נמצא בטווח צפוי. </td></tr><tr><td> פילמור הידרוג&#39;ל polyacrylamide מסכן. </td><td> Underpolymerization. </td><td> הגדל זמן פילמור כדי&gt; 10 דקות (4 W / m 2). בדוק כי פלט UV crosslinker נמצא בטווח צפוי. </td></tr><tr><td> הידרוג polyacrylamide פגומים לאחר הסרת coverglass. </td><td> הידרוג polyacrylamide הרך הם קל לפגוע. </td><td> אנו צופים ירידת תשואת ייצור הידרוג&#39;ל (~ 50%) עבור הרך (כלומר, 4 kPa) הידרוג בפרט. טפל הידרוג בעדינות ולהגדיל מספר המתחיל להשיג תשואה רצויה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> ייצור 2. של מערכים. </td><td rowspan="2"> מורפולוגיה נקודה מסכנה או לא עקבית. </td><td> פונקצית אדים עקבית. </td><td> בדקו אדים ו rheometer פונקציונלי לאורך כל מהדורה ולשמור 65% לחות יחסית. </td></tr><tr><td> סיכות תקועות ראש הדפסה או סותםGED. </td><td> נקה את ראש ההדפסה כדי לאפשר תנועה פינית בחינם. סיכות נקיות ביסודיות לפני או אחרי כל סיבוב הדפסה כדי להסיר אגרגטים מערוצים פיניים. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. תרבית תאים וביצוע Assay. </td><td rowspan="2"> ניתוק או מוות של תאים על מערכים לאחר מצורף ראשוני. </td><td> Overseeding ושגשוגם מוגזם. </td><td> הפחת צפיפות וזמן זריעה ראשונית. השתמש &quot;תחזוקה&quot; או &quot;בידול&quot; תקשורת במהלך התרבות מערך להפחית התפשטות תאים. </td></tr><tr><td> שחרור מונומר acrylamide הרעיל מן הידרוג&#39;ל. </td><td> משרים הידרוג ב DH 2 O לפחות 3 ד כדי לאפשר דיפוזיה / שחרור מונומר acrylamide ולהפחית רעילות לתא. </td></tr><tr><td rowspan="4"> תאים לא לצרף מערכים. </td><td> Underseeding. </td><td> גדל צפיפות וזמן זריעה ראשונית. השתמש בסוג התא חסיד ביתר שאת. </td></tr><tr><td> בתצהיר ירוד שלמטריקס או מצב biomolecule. </td><td> סיכות נקיות של חלקיקים אגרגטים, לאשר פרמטרים להדפסה, ולהעריך תצפית של סמני ניאון, למשל, dextran מצומדות rhodamine. </td></tr><tr><td> ספציפי של אינטראקציות התא-מטריקס. </td><td> סוגי תאים שונים לדבוק דווקא חלק אך לא חלבונים אחרים ECM. מבחן חלבוני ECM שונים מרובים עם התאים שלך. </td></tr><tr><td> אחסון מערך הכי מוצלח לאחר ייצור. </td><td> אנו ממליצים שישמרו מערכים מפוברקים לילה בשעת 65% לחות יחסית וטמפרטורה בחדר, בין שאר כדי למנוע שינויי שלב במהלך הקפאה. הידבקות תא רגישה הוא לחות, טמפרטורה, זמן אחסון; לוודא פרמטרים אלה עולים בקנה אחד / אופטימיזציה עבור הניסויים שלך. </td></tr><tr><td rowspan="2"> ניתוק של הידרוג&#39;ל מן מצע זכוכית במהלך תרבית תאים. </td><td> ניקיון silanization שקופיות מסכנים. </td><td> חלף פתרונות עובדים לניקוי שקופיותsilanization. </td></tr><tr><td> הידרוג&#39;ל Overdehydrated. </td><td> אל תשאירו הידרוג dehydrating על פלטה חשמלית למשך זמן ארוך יותר מאשר 15-30 דקות. </td></tr><tr><td> 4. ניתוח של נתונים. </td><td> שונות גבוהה בין כתמים ומגלשות לשכפל. </td><td> משתנה הוא ייצור מערך. </td><td> בדוק סיכות ראש ההדפסה הם נקיים. אשר פונקצית אדים. דמיינו ולכמת איכות ספוט מערך באמצעות סמנים ניאון. מערכי חנות כמומלצים לעיל. </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פתרון בעיות.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...