Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Riconosciamo Austin Cyphersmith e Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Istituto di Biologia Genomica, University of Illinois a Urbana-Champaign) per l&#39;assistenza con la microscopia e generosamente accogliere schermo e cattura video al centro di microscopia.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nei nostri esperimenti, abbiamo trovato che i guasti più comuni sono legati alla qualità di array fabbricati e poco caratterizzati risposta del sistema biologico che interessa. Rimandiamo il lettore alla Tabella 1 per modalità di guasto comuni in esperimenti di microarray cellulare e procedure di risoluzione associati. Per quanto riguarda la qualità delle matrici, in particolare, si raccomanda quanto segue. Confermare la qualità tecnica e la robustezza di arraying programmi, parametri e tamponi utilizzando molecole fluorescente come destrano rodamina-coniugati. perni Pulire accuratamente prima o dopo arraying secondo le istruzioni del produttore e inoltre visivamente controllare che i canali di pin sono chiari di detriti utilizzando un microscopio ottico. Confermare la ritenzione biomolecola Arrayed con macchie di proteine ​​generali o immunomarcatura. Notare che biomolecole con peso molecolare inferiore a 70 kDa spesso non sono mantenute nel idrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Convalida Arrayed biomolecola cella-funzionalità utilizzando più tipi di cellule. Si noti che solo le cellule aderenti sono compatibili con gli array; Inoltre, l&#39;adesione ad array dipende sia proprietà specifiche delle celle (ad esempio, integrina profilo di espressione) e le proteine ECM selezionati. A causa di spazio limitato, non abbiamo fornito una vasta trattamento di disegno matrice, il layout e la fabbricazione qui e di rimandare il lettore a lavori precedenti 23, 25. Usiamo generalmente 100 sottoarray Spot (150 micron di diametro posto, 450 micron da centro a centro distanza) composti da 10-20 condizioni di biomolecole unici (cioè, 5-10 punti / condizione). Il numero di sotto-array in un array varia a seconda del numero di condizioni biomolecole di interesse, che può essere scalata comodamente fino a 1.280 su un 25 x 75 mm di traslazione microscopio (~ 6.400 punti in 64 sottoarray)xref &quot;&gt; 25, 31 I parametri sopra ulteriormente variare a seconda delle dimensioni del motivo di interesse;. perni atti a generare i motivi da 75 - 450 micron sono facilmente disponibili. esperimenti di array sono meglio integrate da validazione di alta punteggio condizioni schierati di interesse utilizzando altri formati di cultura, letture di analisi e sistemi modello biologico. In particolare, si consiglia di un&#39;ulteriore validazione effetti di selezionare le condizioni disposte utilizzando colture di massa in combinazione con tecniche di biologia molecolare standard (ad esempio, qRT-PCR, immunoblotting) o di serie TFM. La manipolazione genetica (ad esempio, l&#39;abbattimento o sovraespressione) del fattore di interesse per un adeguato sistema di modello biologico può anche servire per confermare gli effetti osservati negli array. In vivo modelli animali rappresentano un altro mezzo di convalida e sono stati recentemente utilizzati, per esempio, per confermare il ruolo centrale di galectin-3 e galectin-8il tumore del polmone metastatico nicchia, come inizialmente identificato tramite microarray cella 31, 49. Un certo numero di altri metodi sono stati usati per sondare regolazione microambientali di funzioni cellulari, compresa una varietà di bidimensionali sistemi microfabbricati 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 e tridimensionali sistemi biomateriale ingegnerizzati 56, 57, 58 , 59, 60, 61. In confronto con altri metodi, i particolari vantaggi della piattaforma microarray cellule descritte qui costituiti da: (1) produzione finocentinaia o migliaia di diverse combinazioni di fattori, consentendo analisi degli effetti di interazione; (2) accessibili, imaging e analisi automatizzata; (3) l&#39;integrazione di entrambe le letture biochimici e biofisici con presentazione controllata di fattori schierati; (4) capacità di variare le proprietà del materiale del substrato; e (5) l&#39;analisi singola cella ad alta contenuto di destino delle cellule e la funzione. In sintesi, la combinazione di microarrays cellulari con TFM su substrati di sintonizzabile rigidità substrato consente caratterizzazione approfondita dei segnali biochimici e biofisici. Come presentato qui, questa piattaforma è generalizzabile e può essere facilmente applicata ad una varietà di tipi di cellule aderenti e dei contesti di tessuto verso una migliore comprensione della regolazione microambientali combinatoria di differenziazione cellulare e meccanotrasduzione.

Le interazioni tra cellule e fattori circostanti microambiente mediare una grande varietà di processi biologici durante lo sviluppo, l&#39;omeostasi, e patogenesi della malattia 1, 2, 3, 4. Queste interazioni microambientali includono la consegna di fattori solubili alle cellule, vincolante cellula-matrice, e le interazioni cellula-cellula tramite legame ligando-recettore. In aggiunta alle considerazioni biochimiche precedenti, i parametri biofisici, come le proprietà meccaniche del substrato (ad esempio, il modulo di Young, porosità) e la forma delle cellule, e meccanotrasduzione valle associati hanno sempre ottenuto il riconoscimento come mediatori chiave del differenziamento cellulare 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. I segnali derivanti da tali interazioni microambientali servono come input per reti geniche e vie di segnalazione. Inoltre, questi componenti cellulari intrinseca anche fornire un feedback al microambiente tramite fattori secreti ed enzimi che degradano matrice, completando un ciclo di coregolamentazione complesso tra i programmi genetici di cellule-intrinseca e dei fattori del microambiente delle cellule-estrinseca 5, 11, 12. L&#39;utilizzo di sistemi ingegnerizzati per la presentazione controllata di fattori microambientali è dimostrato utile in una varietà di contesti diversi 13, 14, 15. Sistemi di microfabbricazione, in particolare, hanno facilitato preciso patterning spaziale delle proteine e cellule, nonché l&#39;analisi altamente parallelo tramite la miniaturizzazione 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays cellulari rappresentano un tale sistema microfabbricazione in cui combinazioni di biomolecole sono contatti stampati su una poliacrilammide idrogel elastica substrato 23, 24, 25. L&#39;inclusione di componenti cellulari-adesivo (cioè proteine ​​della matrice) consente l&#39;adesione sostenuta delle cellule e la cultura su microarray, che è spesso seguita da analisi a valle tramite immunocitochimica e giornalisti fluorescenti. Microarrays cellulari sono stati produttivo orientato verso il raggiungimento di una migliore comprensione del fenotipo delle cellule del fegato 23, 26, neural precursore differenziazione 27, Mammardecisioni y progenitore destino 28, sulle cellule staminali embrionali di manutenzione / differenziazione 23, 29, 30, cancro al polmone metastasi 31, e la risposta terapeutica nel melanoma 32. Abbiamo recentemente dimostrato l&#39;utilizzo di microarray cellulari per definire il ruolo di matrice extracellulare (ECM) composizione proteica nella specifica endoderma 33, fegato progenitore differenziazione 34, 35, e tumori polmonari risposta farmacologica cellule 36. In questi lavori, ci siamo concentrati sulle estendere le capacità combinatorie della piattaforma matrice e ad esplorare le intersezioni di segnalazione cellulare-intrinseco con la composizione della matrice extracellulare e della biomeccanica. Inoltre, abbiamo implementato letture biofisici in questa piattaforma matrice per fornire la capacità di quantitativamente caratterize il ruolo della contrattilità cellulare nel differenziamento elabora 35. Per fare ciò, abbiamo integrato la forza di trazione microscopia (TFM) con microarray cellulari per consentire la valutazione high-throughput di trazione cellule generate. TFM è un metodo ampiamente utilizzato per misurare le forze di trazione cellule generate e fornisce analisi significative circa il coordinamento di singola cellula e la funzione a livello dei tessuti con la composizione e biomeccanica del microambiente locale 37, 38, 39, 40. Così, combinando TFM con microarray cellulari fornisce un sistema high-throughput per la misura chiave, fisiologicamente rilevanti parametri biofisici. La piattaforma microarray cellule qui descritto si compone di quattro sezioni: la fabbricazione di substrati poliacrilammide, fabbricazione di array, colture cellulari e test di lettura e analisi dei dati. VedereFigura 1 per una sintesi schematica delle prime tre sezioni sperimentali; vedi figura 2 per una sintesi schematica della sezione finale con una particolare attenzione per l&#39;analisi dei dati di immunofluorescenza. Al fine di adattare la piattaforma microarray cella per studi di biomeccanica interazioni cellula-substrato, abbiamo utilizzato substrati poliacrilammide di sintonizzabile modulo di Young ma porosità simili, per Wen et al. 41. Per consentire misurazioni TFM delle forze esercitate da cellule sulla loro substrato, abbiamo implementato un Petri formato piatto fondo di vetro in aggiunta al microscopio in vetro spessore diapositive frequentemente utilizzata da altri gruppi. Così, questa piattaforma microarray cellulare è in grado di misurazioni parallele di differenziazione cellulare tramite immunofluorescenza su vetrini da microscopio e le forze di cellule generate tramite TFM sui piatti con fondo di vetro separate. Abbiamo inoltre applicato diversi miglioramenti per l&#39;approccio analitico comunemente utilizzato con microarrays di cellule. specificalmente, invece di parametrico Z-scoring di intensità complessiva dell&#39;isola, si misura l&#39;intensità cella singola e applicare la normalizzazione quantile al fine di tenere conto di distribuzioni non normali e più accuratamente descrivere il comportamento cellulare. Riteniamo che questi miglioramenti forniscono particolare utilità nei confronti indagini dei processi biologici in cui spunti sia biochimici e biofisici giocano importanti ruoli, che si intersecano. Inoltre, i nostri miglioramenti analitici consentono l&#39;applicazione di microarray cellulari per gli studi di una serie di funzioni cellulari per i quali a cella singola e il comportamento a livello di popolazione divergono.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microarrays cellulari microfabbricazione, che consistono in combinazioni di contatti stampati di biomolecole su una superficie elastica idrogel, forniscono un elevato throughput di sistema ingegnerizzato strettamente controllato per misurare l&#39;impatto dei segnali biochimici schierati sulla differenziazione delle cellule. I recenti sforzi utilizzando microarray di cellule hanno dimostrato la loro utilità per gli studi combinatorie in cui molti fattori microambientali sono presentati in parallelo. Tuttavia, questi sforzi si sono concentrati principalmente sulla studio degli effetti di segnali biochimici su risposte delle cellule. Qui vi presentiamo una piattaforma microarray cella con le proprietà del materiale regolabili per valutare sia la differenziazione cellulare mediante immunofluorescenza e biomeccanico cellula-substrato interazioni con la forza di trazione microscopia. Per fare questo, abbiamo sviluppato due diversi formati utilizzando idrogel di poliacrilamide di varia il modulo di Young fabbricato su entrambi i vetrini da microscopio o piatti con fondo di vetro Petri. Forniamo best pratiche e risoluzione di problemi per la realizzazione di microarray su questi substrati idrogel, la successiva coltura cellulare su microarray, e l&#39;acquisizione di dati. Questa piattaforma è particolarmente adatto per l&#39;utilizzo nelle indagini di processi biologici per i quali sia biochimica (ad esempio, la composizione della matrice extracellulare) e biofisica (ad esempio, il substrato rigidità) spunti possono svolgere significativo, si intersecano ruoli.

Utilizzando questa piattaforma, abbiamo studiato il ruolo di entrambi i segnali biochimici e biofisici nella specifica sorte dei progenitori del fegato 34, 35. Proteina A / G Notch coniugato ligandi hanno mostrato una migliore ritenzione e il clustering in idrogel di poliacrilamide (figura 3A) e sono stati, inoltre, in grado di pilotare la differenziazione dei progenitori del fegato verso un destino delle cellule del dotto biliare (Figura 3B). Utilizzando l&#39;analisi singola cellula, abbiamo quantificato la risposta ai ligandi Notch per le proteine ECM collagene, collagene III, collagene IV, fibronectina e laminina (Figura 3C), trovando che la risposta dei progenitori epatici al ligando dipende anche dalla contesto ECM. Ultimo, abbiamo utilizzato shRNA atterramento di generare progenitori epatici senza i ligandi DLL1 e JAG1. La risposta al ligando Notch schierati variava a seconda del presence di entrambi ligando, confermando che la risposta allo ligando cellulare estrinseco è anche una funzione dell&#39;espressione ligando cellulare intrinseca (Figura 3D). Inoltre, abbiamo osservato una sottopopolazione distinto di doppio-positivo (ALB + / + OPN) cellule nel atterramento DLL1 (Figura 3D). Insieme, questi risultati mostrano rappresentative: (1) le capacità combinatorie del formato array, come esemplificato dalla coppia di molteplici schierati proteine ​​ECM e ligandi Notch con l&#39;atterramento di singoli leganti; (2) la funzionalità non solo schierato proteine ​​ECM ma anche schierato ligando cellula-cellula con Proteina A / coniugazione G-mediata; e (3) l&#39;attuazione della nostra analisi singola cellula e la sua capacità di discernere sottopopolazioni unici. Abbiamo anche osservato che la differenziazione di progenitori epatici dipende sia la rigidità del substrato e la composizione ECM (Figura 4A </str<html> ong&gt;), in particolare trovando che il collagene IV è favorevole differenziazione su supporti morbidi e rigidi, mentre fibronectina supporta solo differenziazione su substrati rigidi (Figura 4B). Mappe di calore di misurazioni rappresentative TFM ha suggerito che lo stress prolungato di trazione a bassa rigidità del substrato sul collagene IV provocato differenziazione in cellule del dotto biliare (Figura 4C), un risultato confermato da valori medi di root-mean-square (Figura 4D). Insieme, questi risultati mostrano rappresentative: (1) il successo dell&#39;integrazione di TFM con microarrays di cellule su substrati con una rigidità sintonizzabile per valutare sia il fenotipo cellulare e lo stress di trazione; (2) il coordinamento del destino cellule progenitrici epatiche sia con la composizione della matrice e la rigidità del substrato; e (3) l&#39;attuazione della nostra analisi e tipici profili di stress trazione TFM in microarray cellulari. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Schema che mostra le prime tre sezioni sperimentali. Nella sezione 1, substrati di vetro vengono puliti e silanizzate per facilitare la realizzazione di idrogel di poliacrilamide. Nella sezione 2, le combinazioni di biomolecole di interesse sono preparati in una micropiastra fonte 384 pozzetti. Un Arrayer robotica viene poi caricato con perni pulito, la micropiastra fonte e gli idrogel di poliacrilamide e inizializzato, fabbricare le matrici sulle idrogel. Nella sezione 3, le cellule vengono seminate su domini Arrayed e ha permesso di aderire, al termine del quale viene eseguito il protocollo di cultura di interesse. Al punto finale, le cellule sono fissate per immunoistochimica / immunofluorescenza o analizzati utilizzando TFM. Barre di scala sono 75 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> entro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: elaborazione ed analisi dei dati da immunofluorescenza Array. (A) piastrella, immagini RGB composito a 32 bit vengono prima cestinate e poi suddiviso in singoli canali a 8 bit. Utilizzando una combinazione di marcatori fluorescenti disposte e isole cellulari, sono identificati tre angoli della matrice per consentire l&#39;orientamento automatico e gridding degli array. (B) di dati Single-cellula è generato per ogni canale delle matrici di ingresso. Al fine di tenere conto di deriva sperimentale, la normalizzazione quantile viene applicata da replicare biologica, la produzione di un singolo di distribuzione condivisa in tutte le repliche. Quantile dati normalizzati viene successivamente tracciata ed interpretato tramite calcolo delle misure Ensemble (ad esempio, cellule / isola, intensità media, le cellule percentuale positiva per un etichetta) o di analisi diretta di distribuzioni unicellulari.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Notch Ligand Presentazione Mediazione di fegato Progenitor differenziazione. (A) ligandi Notch Fc-ricombinante Jagged-1 (JAG1) e Delta-simile 1 (DLL1) espone una migliore ritenzione e il clustering, quando schierato con proteina A / G. barra della scala è di 50 micron. Progenitori (B) del fegato differenziate in cellule del dotto biliare al momento della presentazione con Notch ligando. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) è un marchio di nucleare, l&#39;albumina (ALB) è un marker delle cellule epatiche, e osteopontina (OPN) è un marker biliare cellule del condotto. barra della scala è di 150 micron. (C) Quantificazione della percentuale di cellule positive per OPN per i ligandi Notch JAG1, DLL1, e Delta-like 4 (Dll4) sulle proteine ECM collagene I, collagen III, IV collagene, fibronectina e laminina. T -test di Student sono state eseguite contro IgG di controllo per ogni ligando Notch disposte all&#39;interno di ogni proteina ECM con valori di p indicato per P &lt;0,05 (*). (D) Imaging citometria di ALB e OPN per le cellule su collagene III presentati con i ligandi Notch JAG1, DLL1, e Dll4. Progenitori fegato senza il Notch ligandi DLL1 e JAG1 (vale a dire, shDll1 e shJag1) sono stati generati utilizzando shRNA atterramento. Dati in (C) presentati come media ± sem Questa figura è stata modificata da Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: Matrice Composizione e substrato Rigidità Coordinate Fegato Progenitor differenziazione. (A) differenziazione fegato progenitrici biliari cellule del dotto dipende sia composizione ECM e substrato rigidità. DAPI è un&#39;etichetta nucleare, ALB è un marker delle cellule epatiche, e OPN è un marcatore biliare cellule del condotto. (B) Quantificazione della percentuale di cellule positive per OPN su substrati di modulo di Young 30 kPa, 13 kPa, e 4 kPa per il collagene I (C1), collagene IV (C4), fibronectina (FN), e tutti bidirezionali combinazioni di quelle proteine ​​ECM. (C) lo stress cellulare trazione dipende sia rigidità substrato e la composizione ECM. (D) Quantificazione dei valori root-mean-square di stress di trazione su substrati di modulo di Young 30 kPa e 4 kPa per il collagene I (C1), il collagene IV (C4), fibronectina (FN), e tutte le combinazioni a due vie di coloro proteine ​​ECM. In (B) e (D), i dati sono stati presentati come media ± SEM e allievo di t -testsono stati eseguiti contro 30 kPa per ogni combinazione ECM con valori di P indicato per P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), e P &lt;0.001 (***). Barre di scala sono 50 micron. Questa cifra è stata modificata da Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sezione </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> possibili cause </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Realizzazione di Polyacrylamide substrato. </td><td> Coprioggetti non può essere rimosso da idrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Ridurre il tempo di polimerizzazione a &lt;10 minuti (4 W / m 2). Controllare che crossli UVuscita nker è nel raggio d&#39;azione previsto. </td></tr><tr><td> Povero polimerizzazione poliacrilammide idrogel. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentare il tempo di polimerizzazione a&gt; 10 minuti (4 W / m 2). Controllare che l&#39;uscita reticolante UV si trova nel raggio previsto. </td></tr><tr><td> idrogel poliacrilammide sono danneggiati dopo la rimozione del coprioggetti. </td><td> idrogel poliacrilammide morbide sono facili da danneggiare. </td><td> Osserviamo diminuendo la resa idrogel fabbricazione (~ 50%) per il più morbido (ad esempio, 4 kPa) idrogeli in particolare. Maneggiare idrogel delicatamente e aumentare il numero di partenza per raggiungere il rendimento desiderato. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Realizzazione di array. </td><td rowspan="2"> Scarsa o incoerenti morfologia posto. </td><td> funzione di umidificatore incoerente. </td><td> Controllare che umidificatore e reometro un funzionale nel corso di ogni tiratura e di mantenere il 65% di umidità relativa. </td></tr><tr><td> Pins bloccato in testina o intasareGED. </td><td> Pulire la testina di stampa per consentire il movimento del perno libero. perni Pulire accuratamente prima o dopo ogni tiratura per rimuovere aggregati dai canali pin. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. cellulare cultura e test di esecuzione. </td><td rowspan="2"> il distacco delle cellule morte o sugli array dopo il collegamento iniziale. </td><td> Semina e la proliferazione eccessiva. </td><td> Ridurre la densità di semina iniziale e il tempo. Utilizzare &quot;manutenzione&quot; o media &quot;differenziazione&quot; durante la cultura di matrice per ridurre la proliferazione cellulare. </td></tr><tr><td> Rilascio di monomero acrilammide tossici idrogel. </td><td> Immergere idrogel in dH 2 O per almeno 3 d per permettere la diffusione / rilascio di acrilammide monomero e ridurre la tossicità cellulare. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Le cellule non attribuiscono ad array. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentare la densità di semina iniziale e il tempo. Utilizzare un tipo di cellula più fortemente aderente. </td></tr><tr><td> Scarsa deposizione dimatrix o condizione biomolecole. </td><td> Pulire perni di particelle e aggregati, confermano i parametri di stampa, e valutare individuazione di marcatori fluorescenti, ad esempio, rodamina-destrano coniugato. </td></tr><tr><td> Specificità delle interazioni cellula-matrice. </td><td> Differenti tipi di cellule aderiscono specificamente per alcuni, ma non altre proteine ​​ECM. Prova più proteine ​​ECM differenti con le vostre cellule. </td></tr><tr><td> Storage Array non ottimale dopo la fabbricazione. </td><td> Si consiglia di conservare le matrici fabbricati durante la notte a 65% di umidità relativa e temperatura ambiente, in parte per evitare cambiamenti di fase durante il congelamento. L&#39;adesione cellulare è sensibile sia umidità, temperatura e tempo di conservazione; assicurarsi che questi parametri siano coerenti / ottimizzati per i vostri esperimenti. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il distacco di idrogel dal substrato di vetro durante la coltura cellulare. </td><td> pulizia scivolo poveri e silanizzazione. </td><td> Sostituire le soluzioni di lavoro per la pulizia e la slittasilanizzazione. </td></tr><tr><td> idrogel Overdehydrated. </td><td> Non lasciare idrogel disidratanti su un piatto caldo per più di 15-30 minuti. </td></tr><tr><td> 4. Analisi dei dati. </td><td> Alta variabilità tra i punti replicare e diapositive. </td><td> La variabilità della matrice fabbricazione. </td><td> Controllare che i perni e le testine di stampa siano puliti. Confermare la funzione umidificatore. Visualizzare e quantificare posto e la matrice qualità utilizzando marcatori fluorescenti. array conservarlo come raccomandato sopra. </td></tr></tbody></table> Tabella 1: risoluzione dei problemi.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

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