Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Vi erkjenner Austin Cyphersmith og Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institutt for Genomisk Biology, University of Illinois i Urbana-Champaign) for å få hjelp med mikroskopi og for sjenerøst imøtekommende skjerm og videoopptak på mikros kjernen.

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

I våre forsøk har vi funnet at de mest vanlige feil er knyttet til kvaliteten av fabrikkerte matriser og dårlig karakterisert reaksjon i det biologiske system av interesse. Vi henviser leseren til tabell 1 for vanlige feilmodi i celle microarray eksperimenter og tilhørende feilsøkingen. Når det gjelder kvaliteten på arrays i særdeleshet, anbefaler vi følgende. Bekreft den tekniske kvaliteten og robustheten arraying programmer, parametere og buffere bruker fluorescensmerkede molekyler som rhodaminkonjugert dekstran. Rengjør pins enten før eller etter arraying per produsentens instruksjoner og videre visuelt sjekke at PIN-kanaler er fri for rusk å bruke et lysmikroskop. Bekreft Arrayed biomolecule oppbevaring bruke generelle protein flekker eller immunolabeling. Legg merke til at biomolekyler med en molekylvekt under 70 kDa blir ofte ikke holdes tilbake i hydrogelen 23, </<html> sup&gt; 31. Validere Arrayed biomolecule celle-funksjonalitet ved hjelp av flere celletyper. Merk at bare adherente celler er kompatible med matriser; i tillegg, er adhesjon til matriser avhengig av både celle-spesifikke egenskaper (for eksempel integrin uttrykk profil), og de valgte ECM-proteiner. På grunn av begrenset plass, har vi ikke gitt en omfattende behandling av matrise design, layout og fabrikasjon her og henviser leseren til forrige fungerer 23, 25. Vi bruker vanligvis 100 stikk undergrupper (150 mikrometer sted diameter, 450 mikrometer senter-til-senter avstand) består av 10-20 unike biomolekyl forhold (dvs. 5-10 flekker / tilstand). Antallet underordnede rekker i en matrise varierer avhengig av antall biomolekyl tilstander av interesse, som kan være komfortabelt skaleres opp til 1280 på en 25 x 75 mm objektglass (~ 6.400 flekker i 64 undergrupper)xref &quot;&gt; 25, 31 Parametrene ovenfor vil ytterligere variere avhengig av mønsterstørrelsen er av interesse;. nålene som er i stand til å generere mønstre 75-450 um er lett tilgjengelige. Array eksperimenter er best supplert med validering av høy-scoring kledd forhold av interesse ved hjelp av andre kultur formater, analyseavlesninger, og biologiske modellsystemer. Spesielt anbefaler vi ytterligere validering av effekter av utvalgte kledd forholdene ved hjelp av bulk kulturer i forbindelse med standard molekylærbiologiske teknikker (f.eks QRT-PCR, immunoblotting) eller standard TFM. Genetisk manipulasjon (f.eks knockdown eller overekspresjon) av faktor av interesse i et egnet biologisk modellsystem kan også tjene til å bekrefte effektene som observeres i matriser. In vivo dyremodeller representerer en annen metode for validering og ble nylig anvendt, for eksempel, for å bekrefte den sentrale rollen til galectin-3 og galectin-8 ilungekreft metastatisk nisje, som i utgangspunktet identifisert via celle microarray 31, 49. En rekke andre fremgangsmåter har vært anvendt for å probe microenvironmental regulering av cellefunksjoner, inkludert en rekke to-dimensjonale microfabricated-systemer 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 og tredimensjonale konstruerte biomateriale systemer 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I sammenligning med andre metoder, de spesielle fordeler ved cellen microarray plattformen som er beskrevet her består av: (1) gjennomstrømning inntilhundrevis eller tusenvis av forskjellige kombinasjoner av faktorer, slik at analyse av interaksjonseffekter; (2) tilgjengelig, automatisert bildebehandling og analyse; (3) integrering av både biokjemiske og biofysiske avlesninger med kontrollert presentasjon av oppstilt faktorer; (4) evnen til å variere underlaget materialegenskaper; og (5) høyt innhold av single-celle analyse av celle skjebne og funksjon. I sammendraget, en kombinasjon av celle mikromatriser med TFM på underlag av fleksibel substrat stivhet gjør grundig karakterisering av både biokjemiske og biofysiske signaler. Som presenteres her, er denne plattformen generaliseres og kan lett anvendes på en rekke adherente celletyper og vev-kontekster i retning av en forbedret forståelse av kombinatorisk microenvironmental regulering av celledifferensiering og mechanotransduction.

Interaksjoner mellom celler og omkringliggende microenvironmental faktorer formidle et stort utvalg av biologiske prosesser gjennom utvikling, homeostase og sykdommer patogenese en, to, tre, fire. Disse microenvironmental interaksjoner omfatter levering av løselige faktorer til celler, celle-matrise binding, og celle-celle interaksjoner via ligand-reseptor binding. I tillegg til de ovennevnte biokjemiske betraktninger, biofysiske parametre, såsom substratet mekaniske egenskaper (f.eks, Youngs modulus, porøsitet) og celleform, og tilhørende nedstrøms mechanotransduction har i økende grad fått anerkjennelse som viktige mediatorer for celledifferensiering 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Signaler som følge av disse microenvironmental interaksjoner tjene som input til genet nettverk og signalveier. Videre disse celle indre komponenter også gi tilbakemelding til mikromiljøet via skilles faktorer og matrisenedbrytende enzymer, som fullfører en kompleks co-reguleringssløyfe mellom celle iboende genetiske programmer og celle ytre microenvironmental faktorer 5, 11, 12. Bruken av konstruerte systemer for kontrollert fremstilling av microenvironmental faktorer har vist seg nyttig i en rekke forskjellige sammenhenger 13, 14, 15. Microfabricated systemer i særdeleshet har tilrettelagt presis romlige fordelingen av proteiner og celler samt svært parallelized analyse via miniatyrisering 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Celle mikromatriser representere en slik microfabricated system i hvilke kombinasjoner av biomolekyler er kontakt-trykket på en elastisk polyakrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Inkluderingen av celleheftende komponenter (nemlig matriksproteiner) muliggjør vedvarende celleadhesjon og kultur på mikromatriser, som ofte følges av nedstrøms analyse via immunocytokjemi og fluorescerende pressen. Celle mikromatriser er produktivt rettet mot å oppnå en bedre forståelse av leveren celle fenotype 23, 26, nevrale forløper differensiering 27, Mammary stamfar skjebne beslutninger 28, embryonal stamcelle vedlikehold / differensiering 23, 29, 30, kreft metastase 31 lunge, og terapeutisk respons i melanom 32. Vi har nylig vist at bruken av celle mikromatriser for å definere rollen av ekstracellulær matriks (ECM) proteinsammensetningen i endoderm spesifikasjon 33, leverstamcelledifferensiering 34, 35, og lungetumorcellelegemiddelrespons 36. I disse arbeidene, har vi fokusert på å utvide kombinatoriske egenskapene til array plattform og utforske skjæringspunktene celle-egenverdi signale med ekstracellulære matrise sammensetning og biomekanikk. I tillegg har vi implementert biofysiske avlesninger i denne array plattform for å gi muligheten til å kvantitativt kjenneterize rolle celle kontraktilitet i differensieringsprosesser 35. For å gjøre dette, integrert vi trekkraft mikroskopi (TFM) med celle mikromatriser for å muliggjøre høy gjennomstrømming vurdering av celle-generert trekkraft. TFM er en mye brukt metode for å måle cellegenerert trekkrefter og har gitt betydelige innsikt om samordning av enkelt-celle og vev-nivå funksjon med den sammensetning og biomekaniske i den lokale mikro 37, 38, 39, 40. Dermed kombinerer TFM med celle mikromatriser gir en høy gjennomstrømming system for måling av nøkkel, fysiologisk relevante biofysiske parametere. Cellen microarray plattformen er beskrevet her består av fire deler: fabrikasjon av polyakrylamid substrater, fabrikasjon av matriser, cellekulturen og analysen avlesning, og analyse av data. SeFigur 1 på en skjematisk oppsummering av de første tre forsøks seksjoner; se figur 2 for en skjematisk oversikt over den siste delen med fokus på analyse av immunfluorescens data. For å tilpasse den celle microarray plattformen til studier av biomekaniske celle-substrat interaksjoner, brukte vi polyakrylamid-substrater av avstembar Youngs modul, men lignende porøsitet, per Wen et al. 41. For å aktivere TFM måling av krefter som utøves av celler som på deres substrat, gjennomførte vi en glassbunn petriskål format i tillegg til den tykke glassobjektglassene hyppig benyttet av andre grupper. Således er i stand til å parallelle målinger av celledifferensiering via immunfluorescens på objektglass og celle-genererte krefter via TFM på separate glassbunn retter denne cellen microarray plattformen. Vi har også søkt flere forbedringer til den analytiske tilnærmingen er vanlig på celle mikromatriser. specifically, i stedet for parametrisk Z-scoring av generelle øya intensitet, måler vi encellede intensitet og gjelder quantile normalisering for å ta høyde for ikke-normalfordelinger og mer nøyaktig beskrive cellular atferd. Vi mener at disse forbedringene gir særlig nytte mot undersøkelser av biologiske prosesser der både biokjemiske og biofysiske signaler spille viktige, kryssende roller. Videre våre analytiske forbedringer muliggjøre anvendelsen av celle mikromatriser til studier av en rekke cellefunksjoner som enkelt-celle og populasjonsnivå oppførsel divergerer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Microfabricated cellulære mikromatriser, som består av kontakttrykte kombinasjoner av biomolekyler på en elastisk hydrogel overflate, gir en kontrollert, high-throughput konstruert system for å måle effekten av kledd biokjemiske signaler på celledifferensiering. Siste innsats med bruk av celle mikromatriser har vist sin nytte for kombinatoriske studier hvor mange microenvironmental faktorer presenteres i parallell. Imidlertid har dette arbeidet fokusert primært på å undersøke effekten av biokjemiske signaler på celle responser. Her presenterer vi en celle microarray plattform med tunbare materialegenskaper for å vurdere både celledifferensiering av immunfluorescens og biomekanisk celle-substrat interaksjoner med trekkraft mikroskopi. For å gjøre dette, har vi utviklet to forskjellige formater utnytte polyakrylamidprodukter hydrogeler av varierende Youngs modulus fabrikkert på enten objektglass eller glassbunn petriskåler. Vi tilbyr best praksis og feilsøking for fabrikasjon av mikromatriser på følgende hydrogel underlag, den påfølgende cellekultur på mikromatriser, og oppkjøpet av data. Denne plattformen er godt egnet for anvendelse ved undersøkelser av biologiske prosesser hvor det både biokjemiske (f.eks, ekstracellulær matrise-blandingen) og biofysiske (f.eks substrat stivhet) signaler kan spille betydelige, kryssende roller.

Ved hjelp av denne plattform, undersøkte vi rolle både biokjemiske og biofysiske signaler i skjebnen spesifisering av lever forløpere 34, 35. Protein A / G-konjugert Notch ligander viste forbedret retensjon og clustering i polyakrylamid hydrogel (figur 3A) og var dessuten i stand til å kjøre differensiering av leverstamfedre mot en gallegang celle skjebne (figur 3B). Ved hjelp av enkelt-celle analyse, vi kvantifisert reaksjon på de Notch ligander for ECM-proteiner kollagen, kollagen III, collagen IV, fibronektin og laminin (figur 3C), finne at responsen av lever progenitorceller til liganden avhenger også av ECM sammenheng. Sist, benyttet vi shRNA knockdown å generere lever forfedre uten ligander Dll1 og Jag1. Responsen på oppstilt Notch ligand varierte avhengig av presence av enten liganden, som bekrefter at responsen til den celle ytre ligand er også en funksjon av den celle indre ligand ekspresjon (figur 3D). Videre observerte vi en tydelig undergruppe av dobbel-positive (ALB + / OPN +) celler i Dll1 knockdown (figur 3D). Sammen utgjør disse representative resultater viser: (1) den kombinatoriske egenskapene til matrisen format, som eksemplifisert ved sammenkoblingen av flere oppstilt ECM-proteiner og Notch ligander med knockdown av individuelle ligander; (2) funksjonaliteten ikke bare kledd ECM-proteiner, men også oppstilt celle-celle-ligand via protein A / G-mediert konjugasjon; og (3) gjennomføring av våre enkelt-celle-analyse, og dens evne til å skjelne unike subpopulasjoner. Vi har også observert at differensiering av progenitorceller leveren er avhengig av både substratet stivhet og ECM sammensetning (figur 4A </str<html> ong&gt;), spesielt opplever at kollagen IV er støttende for differensiering på både myke og stive underlag mens fibronektin støtter bare differensiering på stive underlag (figur 4B). Representative varme kart TFM målinger antydet at vedvarende trekkraft stress på lav underlaget stivhet på kollagen IV fremmet differensiering i gallegang celler (Figur 4C), et funn bekreftet av gjennomsnittlig root-middel-kvadrat verdier (Figur 4D). Sammen utgjør disse representative resultatene viser: (1) en vellykket integrering av TFM med celle mikromatriser på underlag med en fleksibel stivhet for å vurdere både cellefenotyp og trekkraft stress, (2) samordning av leveren stamcelle skjebne med både matrise-blandingen og substratet stivhet; og (3) gjennomføringen av våre TFM analyse og typiske trekkraft belastningsprofiler i celle mikromatriser. e en &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Oversikt Skjematisk Viser de første tre Eksperimentelle paragrafer. I § ​​1 blir glass underlag rengjøres og HSTTanBeTiandlet å lette fabrikasjon av polyakrylamid hydrogeler. I avsnitt 2 er biomolekyl kombinasjoner av interesse forberedt på en 384-brønnen kilde mikro. En robot arrayer blir så lastet med rene pinner, kilden mikro, og polyakrylamid hydrogeler og initialisert, fabrikasjon arrays på hydrogeler. I avsnitt 3, blir cellene sådd ut på det oppstilt domenene og lov til å følge, hvoretter kulturen protokoll av interesse er utført. Ved endepunktet, blir cellene enten fast for immunocytochemistry / immunfluorescens eller analysert ved hjelp av TFM. Skala barer er 75 mikrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> innen-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figur 2: Behandling og analyse av immunfluorescens data fra Arrays. (A) Flis, kompositt 32-biters RGB-bilder blir først binned og deretter delt inn i individuelle 8-bits-kanaler. Ved hjelp av en kombinasjon av kledd fluorescerende markører og celleøyene, er tre hjørner av matrisen identifisert til å brukes ved automatisk orientering og gridding av oppstillingene. (B) En-celle data genereres for hver kanal av inngangs matriser. For å ta hensyn til eksperimentell drift, er quantile normalisering påføres ved biologisk gjengivelse, som produserer en enkelt delt fordeling på tvers av alle replikater. Quantile normalisert data blir deretter plottet og tolket via beregning av ensemble målinger (f.eks, celler / øy, mener intensitet, prosent celler positive for en etikett) eller direkte analyse av encellede distribusjoner.m / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figur 3: Notch Ligand Presentasjon som megler Liver Progenitor Differensiering. (A) Fc-rekombinant Notch ligander Jagged-en (JAG1) og Delta-lignende en (DLL1) viste forbedret retensjon og clustering når kledd med Protein A / G. Scale bar er 50 mikrometer. (B) Lever forfedre differensiert i gallegang celler ved presentasjon med Notch ligand. 4 &#39;, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) er en kjernefysisk etikett, albumin (ALB) er en levercellemarkør, og osteopontin (OPN) er en gallegang cellemarkør. Scale bar er 150 mikrometer. (C) Kvantifisering av prosentandel av celler positivt for OPN for Notch ligander JAG1, DLL1, og Delta-lignende 4 (DLL4) på ECM proteiner kollagen, collagen III, IV kollagen, fibronektin og laminin. Student t -UNDERSØKELSER ble utført i forhold til kontroll-IgG for hvert oppstilt Notch ligand innenfor hver ECM-protein med P-verdiene som er angitt for P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytometri av ALB og OPN for celler på kollagen III presentert med hakket ligander JAG1, DLL1, og DLL4. Leverstamfedre uten hakk ligander Dll1 og Jag1 (dvs. shDll1 og shJag1) ble generert ved hjelp shRNA knockdown. Data i (C) presentert som gjennomsnitt ± SEM Dette tallet er blitt endret fra Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figur 4: Matrix sammensetning og Substrat Stivhet Coordinate Liver Progenitor Differensiering. (A) Liver stamfar differensiering til gallegang celler er avhengig av både ECM sammensetning og underlaget stivhet. DAPI er en kjernefysisk etikett, ALB er en levercellemarkør, og OPN er en gallegang cellemarkør. (B) Kvantifisering av prosentandelen av celler positive for OPN på substrater av Youngs modul 30 kPa, 13 kPa, og 4 kPa for kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), og alle to-bestanddelers kombinasjoner ifølge disse ECM proteiner. (C) Celle trekkraft spenning er avhengig av både substrat stivhet og ECM sammensetning. (D) Kvantifisering av rot-middel-kvadrat-verdier av trekkraft belastning på substrater av Youngs modul 30 kPa og 4 kPa for kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), og alle to-veis kombinasjoner av disse ECM proteiner. I (B) og (D), ble dataene presentert som gjennomsnitt ± SEM og Student t -UNDERSØKELSERDet ble utført mot 30 kPa for hver ECM kombinasjon med P-verdiene som er angitt for P &lt;0,05 (*) P &lt;0,01 (**), og P &lt;0,001 (***). Skala barer er 50 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Seksjon </td><td fo:width="1.5in"> Problem </td><td fo:width="1.5in"> mulige årsaker </td><td> Løsning </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabrikasjon av polyakrylamid substrat. </td><td> Dekkglass kan ikke fjernes fra hydrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Redusere polymerisasjonstiden til &lt;10 minutter (4 W / m 2). Sjekk at UV crosslinker produksjonen er innenfor forventet område. </td></tr><tr><td> Dårlig polyakrylamid hydrogel polymerisasjon. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Øke polymeriseringstid til&gt; 10 minutter (4 W / m 2). Sjekk at UV tverrbinder produksjonen er innenfor forventet område. </td></tr><tr><td> Polyakrylamid hydrogeler er skadet etter fjerning av dekkglass. </td><td> Myke polyakrylamid hydrogeler er lett å skade. </td><td> Vi observerer minkende hydrogel fabrikasjon yield (~ 50%) for den mykeste (dvs. 4 kPa) hydrogeler spesielt. Håndtak hydrogeler forsiktig og øke startnummer for å oppnå ønsket utbytte. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Fabrikasjon av matriser. </td><td rowspan="2"> Dårlig eller inkonsekvent sted morfologi. </td><td> Inkonsekvent luftfukter funksjon. </td><td> Sjekk at luftfukter og rheometer en funksjonell gjennom hver opplag og vedlikeholde 65% RF. </td></tr><tr><td> Pins fast i skrivehodet eller tetteged. </td><td> Rengjør skrivehodet for å tillate fri pin bevegelse. Rengjør pins grundig før eller etter hver utskriftsjobb for å fjerne aggregater fra pin-kanaler. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cellekultur og analyse Execution. </td><td rowspan="2"> Cell avløsning eller død på arrays etter første vedlegg. </td><td> Seeding og overdreven spredning. </td><td> Redusere initial seeding tetthet og tid. Bruk &quot;vedlikehold&quot; eller &quot;differensiering&quot; media under rekke kultur for å redusere celleproliferasjon. </td></tr><tr><td> Frigjøring av giftig akrylamid monomer fra hydrogel. </td><td> Sug hydrogeler i dH 2 O i minst 3 dager for å tillate diffusjon / frigjøring av akrylamidmonomer og redusere celletoksisitet. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Cellene ikke feste til arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Øke initial seeding tetthet og tid. Bruk en sterkere tilhenger celletype. </td></tr><tr><td> Dårlig avsetning avmatrise eller biomolekyl tilstand. </td><td> Rengjør pins av partikler og aggregater, bekrefte utskriftsparametere og vurdere spotting av fluorescerende markører, f.eks rhodaminkonjugert dekstran. </td></tr><tr><td> Spesifisitet av celle-matriks-interaksjoner. </td><td> Ulike celletyper holder seg spesielt til noen, men ikke andre ECM proteiner. Teste flere ulike ECM proteiner med cellene. </td></tr><tr><td> Suboptimal rekke lagring etter fabrikasjon. </td><td> Vi anbefaler å lagre fabrikkerte arrays over natten ved 65% RF og romtemperatur, blant annet for å unngå faseendringer under frysing. Celleadhesjon er følsom for både fuktighet, temperatur og lagringstid; sørge for at disse parametrene er konsistente / optimalisert for eksperimentene. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Løsgjøring av hydrogel fra glass-substrat under cellekultur. </td><td> Dårlig lysbilde rengjøring og silanisering. </td><td> Skift arbeidsløsninger for lysbilde rengjøring ogsilanisering. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hydrogel. </td><td> Ikke la hydrogeler dehydrerende på en varm plate i mer enn 15-30 min. </td></tr><tr><td> 4. Analyse av data. </td><td> Høy variasjon mellom replikere flekker og lysbilder. </td><td> Variasjon i matrisen fabrikasjon. </td><td> Sjekk at pinnene og skrivehodet er rene. Bekreft luftfukter funksjon. Visualisere og kvantifisere sted og rekke kvalitet ved hjelp av fluorescerende markører. Lagre arrays som anbefalt ovenfor. </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Feilsøking.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Celledifferensiering er regulert av en rekke microenvironmental faktorer, blant annet matrise sammensetning og underlaget materialegenskaper begge. Vi beskriver her en teknikk for anvendelse av mikromatriser celle i forbindelse med trekkraft mikroskopi for å evaluere både celledifferensiering og biomekaniske celle-substrat interaksjoner som en funksjon av microenvironmental sammenheng.

En High-throughput Cell microarray plattform for samsvarende analyse av celledifferensiering og Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat Microcapsule som en 3D-plattform for Formering og Differensiering av humane embryonale stamceller (hESC) til ulike linjene

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Høy gjennomstrømning encellede og Multiple-celle Micro-innkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Samsvarende Mikroskopi for 3D Structural Analysis of Dynamic Interaksjoner

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En allsidig Automated Plattform for Micro-skala Cell Stimulering Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching plattform for applikasjoner i celler og vev mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikrofluid plattform for High-throughput encellede Isolering og kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...