Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Nós reconhecemos Austin Cyphersmith e Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Instituto de Biologia genômica, Universidade de Illinois em Urbana-Champaign) para assistência com microscopia e para generosamente acomodar tela e captura de vídeo no centro de microscopia.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nas nossas experiências, verificou-se que as deficiências mais comuns estão relacionados com a qualidade das matrizes fabricadas e mal caracterizado resposta no sistema biológico de interesse. Nós nos referimos ao leitor a Tabela 1 para os modos de falha comuns em experimentos de microarranjos celular e passos de resolução de problemas associados. Em relação à qualidade de matrizes em particular, recomendamos o seguinte. Confirmar a qualidade técnica e robustez do arraying programas, parâmetros e buffers usando moléculas fluorescente etiquetado como dextrano rodamina conjugada. pins completamente limpas antes ou depois predispor acordo com as instruções do fabricante e ainda verificar visualmente que os canais de pinos são livre de detritos usando um microscópio de luz. Confirmar retenção biomolécula vestida usando manchas de proteínas gerais ou imunomarcação. Note-se que as biomoléculas com um peso molecular abaixo de 70 kDa, não são frequentemente retidas em que o hidrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Validar células-funcionalidade biomolécula vestiu o uso de vários tipos de células. Note-se que apenas as células aderentes são compatíveis com matrizes; Além disso, a aderência a matrizes é dependente de ambas as propriedades específicas de células (por exemplo, o perfil de expressão de integrina) e as proteínas da MEC seleccionados. Devido ao espaço limitado, que não forneceram um extenso tratamento de projeto matriz, layout, e fabricação aqui e remeter o leitor a trabalhos anteriores 23, 25. Geralmente usamos 100 subarrays pontos (150 de diâmetro mm local, 450 mm de distância de centro a centro), composto por 10-20 condições de biomoléculas exclusivos (ie, 5-10 pontos / condição). O número de submatrizes em uma matriz varia, dependendo do número de condições de biomoléculas de interesse, o que pode ser confortavelmente dimensionada até 1280 em uma lâmina de microscópio de 25 x 75 mm (~ 6.400 pontos em 64 submatrizes)refex &quot;&gt; 25, 31 Os parâmetros acima irão variar ainda mais, dependendo do tamanho padrão de interesse;. pinos capazes de gerar padrões de 75-450 | iM são facilmente disponíveis. experimentos de matriz são melhor complementados pela validação de alta pontuação condições dispostas de interesse usando outros formatos cultura, leituras de ensaio e sistemas de modelos biológicos. Especificamente, recomendamos validar ainda mais os efeitos de selecionar condições dispostas utilizando culturas a granel em conjunto com técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, qRT-PCR, immunoblotting) ou TFM padrão. A manipulação genética (por exemplo, a sobre-expressão ou knockdown) do factor de interesse num sistema de modelo biológico adequado pode servir também para confirmar os efeitos observados em matrizes. Em modelos animais in vivo representam um outro meio de validação e foram recentemente utilizados, por exemplo, para confirmar o papel central da galectina-3 e galectina-8 emo cancro do pulmão metastático nicho, como inicialmente identificado através de microarray de células 31, 49. Uma série de outros métodos têm sido utilizados para sondar regulação microambiental de funções celulares, incluindo uma variedade de dois-dimensional sistemas microfabricated 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 e tridimensionais sistemas de biomateriais engenharia 56, 57, 58 , 59, 60, 61. Em comparação com outros métodos, as vantagens particulares da plataforma de microarray de células descritas aqui consistem em: (1) saída de atécentenas ou milhares de diferentes combinações de factores, permitindo a análise dos efeitos de interacção; (2) acessíveis, de imagem e análise automatizada; (3) integração de ambas as leituras bioquímicas e biofísicas com apresentação controlada de factores dispostas; (4) capacidade de variar as propriedades do material de substrato; e (5) a análise de uma única célula de alto teor de destino e a função da célula. Em resumo, a combinação de microarrays de células com TFM em substratos de rigidez do substrato sintonizável permite a caracterização completa de ambos os sinais bioquímicos e biofísicos. Tal como aqui apresentado, esta plataforma é generalizável e pode ser facilmente aplicado a uma variedade de tipos de células aderentes e contextos de tecido para uma melhor compreensão da regulação microambiental combinatória de diferenciação celular e mecanotransdução.

As interacções entre células vizinhas e factores micro-ambientais mediar uma grande variedade de processos biológicos ao longo do desenvolvimento, homeostase e doenças patogénese 1, 2, 3, 4. Estas interacções incluem microambiente entrega de factores solúveis para as células, a ligação de células-matriz, e interacções célula-célula através da ligação ligando-receptor. Para além das considerações bioquímicas acima, os parâmetros biofísicas, tais como as propriedades mecânicas do substrato (por exemplo, o módulo de Young, a porosidade) e forma da célula, e mecanotransdução jusante associada têm cada vez mais ganhou reconhecimento como os principais mediadores da diferenciação celular da 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Sinais resultantes dessas interações microambiente servem como entradas para redes de genes e vias de sinalização. Além disso, esses componentes da célula-intrínseca também fornecer feedback para o microambiente via fatores secretados e enzimas que degradam a matriz, completando um ciclo de co-regulação complexa entre programas genéticos de células-intrínseca e fatores do microambiente de células-extrínseca 5, 11, 12. A utilização de sistemas de engenharia para a apresentação controlada de factores micro-ambientais mostrou-se útil numa variedade de contextos diferentes 13, 14, 15. Sistemas microfabricados em particular, têm facilitado modelação espacial precisa de proteínas e células, bem como a análise altamente paralelizado através miniaturização 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays celulares representam um tal sistema microfabricado em que combinações de biomoléculas são para um hidrogel de poliacrilamida substrato elástico 23, 24, 25 impressos-contacto. A inclusão de componentes de células-adesivo (nomeadamente proteínas da matriz) permite a adesão sustentada cultura de células e em microarrays, que é frequentemente seguida de análise a jusante através de imunocitoquímica e repórteres fluorescentes. Microarrays celulares foram produtiva orientada para alcançar uma melhor compreensão do fenótipo das células do fígado 23, 26, diferenciação neural precursor 27, Mammardecisões y progenitor destino 28, células-tronco embrionárias de manutenção / diferenciação 23, 29, 30, metástase de câncer de pulmão 31 e resposta terapêutica em pacientes com melanoma 32. Nós demonstramos recentemente, a utilização de microarranjos de células para definir o papel de matriz extracelular (ECM) na composição de proteína especificação endoderme 33, fígado progenitoras diferenciação 34, 35, e de tumor de pulmão de células 36 a resposta à droga. Nestes trabalhos, temos nos concentrado em estender as capacidades combinatórias da plataforma matriz e explorar as interseções de sinalização celular-intrínseca com composição da matriz extracelular e biomecânica. Além disso, temos implementado leituras biofísicos nesta plataforma de matriz para fornecer a capacidade de quantitativamente caracteterize o papel da contractilidade celular na diferenciação processa 35. Para fazer isso, integramos microscopia de força de tração (TFM) com microarrays de células para permitir a avaliação de alto rendimento de tração gerada por células. TFM é um método amplamente utilizado para medir forças de tração gerada por células e forneceu insights significativos sobre a coordenação de uma única célula e função em nível de tecido com a composição e biomecânica do microambiente local, 37, 38, 39, 40. Assim, combinando TFM com microarrays celulares fornece um sistema de alto rendimento para medir principais parâmetros biofísicos, fisiologicamente relevantes. A plataforma de microarray celular aqui descrita consiste em quatro seções: a fabricação de substratos de poliacrilamida, fabricação de matrizes, cultura de células e leitura de ensaio e análise de dados. VejoA Figura 1 para um resumo esquemático dos primeiros três secções experimentais; veja a Figura 2 para um resumo esquemático da secção final com foco em análise de dados de imunofluorescência. A fim de adaptar a plataforma de microarray celular para estudos de interações-substrato celular biomecânicos, foram utilizados substratos de poliacrilamida de módulo ajustável de Young, mas porosidade semelhante, por Wen et al. 41. Para habilitar medições TFM de forças exercidas por células no seu substrato, foi implementado um formato de placa de Petri com fundo de vidro, além do microscópio de vidro grosso lâminas freqüentemente utilizada por outros grupos. Assim, esta plataforma de microarray célula é capaz de medições paralelas de diferenciação celular, através de imunofluorescência em lâminas de microscópio e as forças geradas por celulares via TFM em pratos com fundo de vidro separados. Temos também aplicadas várias melhorias para a abordagem analítica utilizada com microarrays celulares. specifically, em vez de paramétrico Z-pontuação da intensidade global ilha, medir a intensidade de uma única célula e aplicar a normalização quantil, a fim de explicar as distribuições não-normais e com mais precisão descrever o comportamento celular. Acreditamos que essas melhorias fornecem uma utilidade particular para com investigações de processos biológicos em que sinais bioquímicos e biofísicos jogar, papéis de interseção significativos. Além disso, os nossos melhorias analíticos permitir a aplicação de microarrays de células para estudos de uma série de funções celulares para os quais de uma única célula e comportamento de nível população divergem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microarrays celulares microfabricated, que consistem em combinações impressa contato de biomoléculas em uma superfície hidrogel elástico, fornecer um alto throughput sistema rigidamente controlado, projetado para medir o impacto de sinais bioquímicos dispostas na diferenciação celular. Esforços recentes utilizando microarrays de células têm demonstrado a sua utilidade para estudos combinatórios em que muitos fatores do microambiente são apresentados em paralelo. No entanto, estes esforços têm focado principalmente na investigação dos efeitos dos sinais bioquímicos sobre as respostas celulares. Aqui, apresentamos uma plataforma de microarray célula com propriedades materiais ajustáveis ​​para avaliar tanto a diferenciação celular por interações de imunofluorescência e célula-substrato biomecânica por microscopia de força de tração. Para fazer isso, nós desenvolvemos dois formatos diferentes, utilizando hidrogéis de poliacrilamida de diferentes módulo de Young fabricado em ambos lâminas de microscópio ou placas de Petri com fundo de vidro. Nós fornecemos bespráticas t e solução de problemas para a fabricação de microarrays nesses substratos de hidrogel, a cultura de células subsequente sobre microarrays, e aquisição de dados. Esta plataforma está bem adequada para uso em investigações de processos biológicos para os quais tanto bioquímicos (por exemplo, a composição da matriz extracelular) e biofísico (por exemplo, rigidez) do substrato pistas podem desempenhar significativa, intersectando papéis.

Usando esta plataforma, investigou-se a papel de ambos os sinais bioquímicos e biofísicos na especificação de destino progenitoras do fígado 34, 35. Ligandos / Notch L-conjugado de proteína A mostrou uma melhor retenção e o agrupamento em que o hidrogel de poliacrilamida (Figura 3A) e foram, além disso, capaz de dirigir a diferenciação de células progenitoras do fígado para um destino celular ducto biliar (Figura 3B). Usando a análise de uma única célula, que quantificada a resposta aos ligandos de entalhe para as proteínas da MEC colagénio I, colagénio III, colagénio IV, fibronectina e laminina (Figura 3C), considerando que a resposta de células progenitoras do fígado para o ligando depende também da contexto ECM. Última, utilizamos shRNA knockdown para gerar as progenitoras do fígado sem os ligantes DLL1 e Jag1. A resposta ao ligando Notch dispostas variou de acordo com o presence de qualquer ligando, o que confirma que a capacidade de resposta ao ligando das células-extrínseca é também uma função da expressão de ligando de células-intrínseca (Figura 3D). Além disso, observou-se uma subpopulação distinta de duplo positivo (ALB + / + OPN) em células do knockdown DLL1 (Figura 3D). Juntos, esses resultados representativos mostram: (1) as capacidades combinatórias do formato de matriz, como exemplificado pelo emparelhamento de vários vestiu proteínas da MEC e ligantes Notch com o knockdown de ligantes individuais; (2) a funcionalidade da dispostas não só proteínas ECM, mas também dispostas ligando-célula através de proteína A / G-conjugação mediada; e (3) a implementação de nossa análise de uma única célula e sua capacidade de discernir subpopulações únicas. Observou-se também que a diferenciação de células progenitoras hepáticas é dependente tanto a rigidez do substrato e a composição de ECM (Figura 4A </str<html> ong&gt;), especificamente encontrar que o colagénio IV é favorável à diferenciação em ambos os substratos macios e duros, enquanto fibronectina suporta apenas a diferenciação em substratos rígidos (Figura 4B). Mapas de calor representativas das medições da TFM sugeriu que o estresse de tração sustentado a baixa rigidez substrato sobre o colágeno IV promoveu a diferenciação em células do ducto biliar (Figura 4C), um achado confirmado por valores médios root mean square (Figura 4D). Juntos, esses resultados representativos mostram: (1) a integração bem sucedida de TFM com microarrays de células em substratos com uma rigidez ajustável para avaliar tanto o fenótipo celular e o estresse de tração; (2) a coordenação do destino das células progenitoras do fígado, com tanto a composição da matriz e a rigidez do substrato; e (3) a implementação da nossa análise e típicos perfis de estresse de tração TFM em microarrays celulares. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Visão esquemática que mostra os primeiros três seções experimentais. Na Seção 1, substratos de vidro são limpos e silanizada para facilitar a fabricação de hidrogéis de poliacrilamida. Na secção 2, as combinações de biomoléculas de interesse são preparados de uma fonte de microplacas de 384 poços. A arrayer robótico é então carregado com pinos limpas, a microplaca fonte, e os hidrogéis de poliacrilamida e inicializado, fabricação de matrizes nos hidrogéis. No ponto 3, as células são semeadas sobre os domínios dispostas e deixadas a aderir, após o qual o protocolo de cultura de interesse é realizada. No ponto final, as células ou são fixadas por imunocitoquímica / imunofluorescência ou analisados ​​por meio de TFM. As barras de escala são 75 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> dentro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: Processamento e Análise de imunofluorescência dados de matrizes. (A) de Azulejo, imagens RGB compostas de 32 bits são primeiro binned e depois dividido em canais de 8 bits individuais. Usando uma combinação de marcadores fluorescentes dispostas e ilhas de células, três cantos da matriz são identificadas para permitir a orientação automatizado e gridding das matrizes. (B) dados de uma única célula é gerado para cada canal dos arrays de entrada. A fim de explicar o desvio experimental, a normalização quantil é aplicado por replicar biológica, produzindo uma única distribuição compartilhada entre todas as repetições. Quantile de dados normalizado é posteriormente plotados e interpretada por cálculo das medições do conjunto (por exemplo, células / ilha, intensidade média, as células percentuais positivos para uma etiqueta) ou análise direta de distribuições de uma única célula.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Apresentação Notch Ligando medeia fígado Progenitor diferenciação. (A) Notch Fc recombinante ligantes Jagged-1 (JAG1) e Delta-like 1 (DLL1) apresentaram maior retenção e clustering quando vestida com Proteína A / G. barra de escala é de 50 mm. Progenitores (B) do fígado diferenciadas em células do ducto biliar mediante a apresentação com ligando de Notch. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) é um marcador nuclear, albumina (ALB) é um marcador de célula hepática, e osteopontina (OPN) é um marcador de células do ducto biliar. barra de escala é de 150 mm. (C) Quantificação da percentagem de células positivas para OPN para os ligandos Notch JAG1, DLL1, e semelhante a delta 4 (Dll4) sobre as proteínas da MEC colagénio I, collagen III, colágeno IV, fibronectina e laminina. -Testes T de Student foram realizados contra a IgG de controlo para cada ligando Notch vestida dentro de cada proteína ECM com valores P indicada para P &lt;0,05 (*). (D) Imagem citometria de ALB e OPN para as células no colagénio III apresentados com os ligantes Notch JAG1, DLL1 e DLL4. Progenitoras do fígado sem a Notch ligantes DLL1 e Jag1 (ie, shDll1 e shJag1) foram gerados usando shRNA knockdown. Os dados em (C) apresentados como média ± SEM Esta figura foi modificado a partir do Kaylan et ai. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: composição da matriz e do substrato Rigidez Coordinate fígado Progenitor diferenciação. (A) a diferenciação de células progenitoras do fígado contra células biliares é dependente tanto a composição ECM e rigidez substrato. DAPI é um marcador nuclear, ALB é um marcador de célula hepática, e o OPN é um marcador de células do ducto biliar. (B) Quantificação da percentagem de células positivas para OPN em substratos de módulo de Young de 30 kPa, 13 kPa, e 4 kPa para o colagénio I (C1), colagénio IV (C4), a fibronectina (FN), e todas as duas combinações diferentes de essas proteínas da MEC. (C) o estresse de tração celular é dependente tanto rigidez substrato e composição ECM. (D) A quantificação dos valores de raiz quadrada média de estresse de tração em substratos do módulo de Young de 30 kPa e 4 kPa para colágeno I (C1), colágeno IV (C4), fibronectina (FN), e todos bidirecionais combinações desses proteínas da MEC. Em (B) e (D), os dados foram apresentados como média ± do SEM e aluno -Testes tForam realizadas contra 30 kPa para cada combinação de ECM com valores P indicada para P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), e P &lt;0,001 (***). As barras de escala são 50 uM. Este valor foi modificado a partir Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Seção </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> Causas potenciais </td><td> Solução </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabricação de poliacrilamida substrato. </td><td> Lamela não pode ser removida do hidrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reduzir o tempo de polimerização para &lt;10 minutos (4 W / m 2). Verifique se crossli UVsaída nker está dentro do intervalo esperado. </td></tr><tr><td> Pobre de polimerização de poliacrilamida hidrogel. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentar o tempo de polimerização para&gt; 10 minutos (4 W / m 2). Verifique se a saída de reticulação UV está dentro do intervalo esperado. </td></tr><tr><td> hidrogeles de poliacrilamida são danificadas após a remoção da lamela. </td><td> hidrogéis de poliacrilamida macios são fáceis de danificar. </td><td> Observamos diminuição de rendimento hidrogel de fabricação (~ 50%) para o mais macio (ou seja, 4 kPa) hidrogéis em particular. Lidar com hidrogéis suave e aumentar o número de partida para alcançar o rendimento desejado. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Fabricação de matrizes. </td><td rowspan="2"> morfologia local pobre ou inconsistente. </td><td> função umidificador inconsistente. </td><td> Verifique se umidificador e reï¿½etro um funcional ao longo de cada tiragem e manter 65% RH. </td></tr><tr><td> Pinos preso no cabeçote de impressão ou obstruçãoGED. </td><td> Limpar a cabeça de impressão para permitir o movimento do pino livre. pins limpar cuidadosamente antes ou depois de cada impressão para remover agregados de canais pinos. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cultura de Células e Execução de Ensaio. </td><td rowspan="2"> descolamento celular ou morte em matrizes após a fixação inicial. </td><td> Overseeding e proliferação excessiva. </td><td> Reduzir a densidade de sementeira inicial e tempo. Use &quot;manutenção&quot; ou mídia &quot;diferenciação&quot; durante a cultura matriz para reduzir a proliferação celular. </td></tr><tr><td> Liberação de monômero acrilamida tóxicos do hidrogel. </td><td> Soak hidrogeles em dH2O durante pelo menos 3 d para permitir a difusão / libertação de monómero de acrilamida e reduzir a toxicidade celular. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Células não anexar a matrizes. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentar a densidade de sementeira inicial e tempo. Use um tipo de célula mais fortemente aderente. </td></tr><tr><td> Pobre deposição dematriz ou condição biomolécula. </td><td> Pins limpas de partículas e agregados, confirmar parâmetros de impressão, e avaliar manchas de marcadores fluorescentes, por exemplo, dextrano rodamina conjugada. </td></tr><tr><td> A especificidade das interacções célula-matriz. </td><td> Diferentes tipos de células aderem especificamente para alguns, mas não outras proteínas de ECM. Testar várias proteínas ECM diferentes, com suas células. </td></tr><tr><td> matriz de armazenamento abaixo do ideal após a fabricação. </td><td> Recomendamos armazenar matrizes fabricadas durante a noite a 65% de umidade relativa e temperatura ambiente, em parte para evitar mudanças de fase durante o congelamento. A adesão celular é sensível a ambas humidade, temperatura, e tempo de armazenamento; certifique-se estes parâmetros são consistentes / otimizado para suas experiências. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Destacamento de hidrogel a partir de substrato de vidro durante a cultura de células. </td><td> Pobre limpeza slide e silanização. </td><td> Substitua soluções de trabalho para a limpeza de slides esilanização. </td></tr><tr><td> hidrogel Overdehydrated. </td><td> Não deixe hidrogéis de desidratação em uma chapa quente por mais de 15-30 min. </td></tr><tr><td> 4. Análise de Dados. </td><td> Alta variabilidade entre os pontos em duplicado e slides. </td><td> A variabilidade na fabricação matriz. </td><td> Verifique se os pinos e cabeçote de impressão estão limpos. Confirmar função do umidificador. Visualizar e quantificar local e matriz qualidade utilizando marcadores fluorescentes. matrizes loja como recomendado acima. </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Solução de problemas.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

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