Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Reconocemos Austin Cyphersmith y Mayandi Sivaguru (Carl Woese Instituto de Biología Genómica R., Universidad de Illinois en Urbana-Champaign) para obtener ayuda con la microscopía y para la pantalla y captura de vídeo con capacidad generosamente en el centro de microscopía.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En nuestros experimentos, hemos encontrado que los fallos más comunes están relacionados con la calidad de las matrices fabricadas y pobremente caracterizados respuesta en el sistema biológico de interés. Remitimos al lector a la Tabla 1 para los modos de fallo comunes en los experimentos de microarrays de células y pasos para solucionar problemas asociados. En cuanto a la calidad de las matrices, en particular, se recomienda lo siguiente. Confirmar la calidad técnica y la solidez de poner en orden los programas, parámetros y tampones que usan moléculas marcadas con fluorescencia, tales como dextrano conjugado con rodamina. pasadores limpiar a fondo, ya sea antes o después de poner en orden según las instrucciones del fabricante, y aún más visualmente comprobar que los canales de espiga son libres de desechos utilizando un microscopio de luz. Confirmar la retención biomolécula puso en orden el uso de manchas de proteínas generales o inmunomarcaje. Tenga en cuenta que las biomoléculas con un peso molecular inferior a 70 kDa con frecuencia no se retienen en el hidrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Validar puso en orden el biomolécula célula funcionalidad mediante múltiples tipos de células. Tenga en cuenta que sólo las células adherentes son compatibles con las matrices; Además, la adherencia a las matrices depende tanto de las propiedades de células específicas (por ejemplo, perfil de expresión de integrina) y las proteínas de la MEC seleccionados. Debido al espacio limitado, no hemos proporcionado un extenso tratamiento de la gama de diseño, el diseño y la fabricación aquí y remitir al lector a trabajos previos 23, 25. Generalmente usamos 100 subarreglos punto (150 micras de diámetro punto, 450 m de centro a centro de distancia) compuestas de 10-20 condiciones de biomoléculas únicos (es decir, 5-10 puntos / condición). El número de subconjuntos en una matriz varía en función del número de condiciones de biomoléculas de interés, que se puede escalar cómodamente hasta 1280 en un 25 × 75 mm portaobjetos de microscopio (~ 6.400 puntos en 64 submatrices)xref &quot;&gt; 25, 31 de los parámetros anteriores variarán más dependiendo del tamaño del patrón de interés;. pines capaces de generar patrones de 75 a 450 micras están fácilmente disponibles. serie de experimentos se complementan con mejor validación de alta puntuación condiciones dispuestas de interés utilizando otros formatos de cultivo, las lecturas de ensayo, y sistemas de modelos biológicos. Específicamente, sugerimos validar aún más los efectos de las condiciones dispuestas seleccione utilizando cultivos en masa en conjunción con técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, QRT-PCR, inmunotransferencia) o estándar de TFM. La manipulación genética (por ejemplo, desmontables o sobreexpresión) del factor de interés en un sistema modelo biológico adecuado también puede servir para confirmar los efectos observados en las matrices. En modelos animales in vivo representan otro medio de validación y se utilizaron recientemente, por ejemplo, para confirmar el papel central de la galectina-3 y la galectina-8 enel cáncer de pulmón metastásico nicho, como se identificó inicialmente a través de microarrays de células 31, 49. Un número de otros métodos se han utilizado para investigar la regulación microambientales de funciones celulares, incluyendo una variedad de dos dimensiones sistemas microfabricados 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y tridimensionales sistemas de biomateriales de ingeniería 56, 57, 58 , 59, 60, 61. En comparación con otros métodos, las ventajas particulares de la plataforma de microarrays de células descritas aquí consisten en: (1) un rendimiento de hastacientos o miles de diferentes combinaciones de factores, lo que permite el análisis de los efectos de interacción; (2), de formación de imágenes automatizado accesible y análisis; (3) la integración de las dos lecturas bioquímicas y biofísicas con la presentación controlada de factores desplegadas; (4) capacidad de variar las propiedades del material de sustrato; y (5) de alto contenido de análisis de una sola célula de destino celular y la función. En resumen, la combinación de microarrays de células con TFM sobre sustratos de rigidez sustrato sintonizable permite la caracterización exhaustiva de las dos señales bioquímicas y biofísicas. Tal como se presenta aquí, esta plataforma es generalizable y se puede aplicar fácilmente a una variedad de tipos de células adherentes y contextos de tejido hacia una mejor comprensión de la regulación microambientales combinatoria de la diferenciación celular y mechanotransduction.

Las interacciones entre las células y factores microambientales rodean mediar una gran variedad de procesos biológicos en todo el desarrollo, la homeostasis, y la patogénesis 1, 2, 3, 4 enfermedad. Estas interacciones microambientales incluyen la entrega de factores solubles a las células, la unión célula-matriz, y las interacciones célula-célula a través de la unión del ligando-receptor. Además de las consideraciones bioquímicas anteriores, los parámetros biofísicos, como las propiedades mecánicas de sustrato (por ejemplo, el módulo de Young, la porosidad) y forma de la célula, y mechanotransduction aguas abajo asociados han ganado cada vez más reconocimiento como mediadores clave de la diferenciación de células 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Las señales resultantes de estas interacciones microambientales sirven como entradas a las redes de genes y vías de señalización. Por otra parte, estos componentes de células intrínseca también proporcionan retroalimentación al microambiente a través de factores secretados y enzimas que degradan la matriz, que completaron un complejo bucle co-regulación entre los programas genéticos de células intrínseca y factores microambientales de células extrínseca 5, 11, 12. El uso de sistemas de ingeniería para la presentación controlada de factores microambientales ha demostrado ser útil en una variedad de diferentes contextos 13, 14, 15. Sistemas microfabricados en particular, han facilitado patrón espacial precisa de las proteínas y células, así como análisis altamente paralelizado a través de la miniaturización 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays de células representan un sistema de este microfabricado en el que las combinaciones de biomoléculas son el contacto-impreso sobre un sustrato de poliacrilamida elástico de hidrogel 23, 24, 25. La inclusión de componentes de células de adhesivo (es decir, proteínas de la matriz) permite la adhesión sostenida cultivo de células y en microarrays, que es seguido a menudo por el análisis de aguas abajo a través de inmunocitoquímica y reporteros fluorescentes. Células microarrays han sido productiva dirigida hacia el logro de una mejor comprensión del fenotipo de células hepáticas 23, 26, neural diferenciación precursora 27, Mammardecisiones y destino progenitora 28, embrionaria de células madre de mantenimiento / diferenciación 23, 29, 30, 31 metástasis del cáncer de pulmón, y la respuesta terapéutica en el melanoma 32. Recientemente hemos demostrado el uso de células microarrays para definir el papel de la matriz extracelular (ECM) composición de proteínas en la especificación endodermo 33, el hígado progenitora diferenciación 34, 35, y la respuesta a los fármacos de células tumorales de pulmón 36. En estas obras, nos hemos centrado en la ampliación de las capacidades combinatorias de la gama plataforma y explorar las intersecciones de señalización de las células intrínseca con la composición de la matriz extracelular y la biomecánica. Además, hemos puesto en marcha lecturas biofísicos en esta gama plataforma para proporcionar cuantitativamente la capacidad de caracrizar el papel de la contractilidad celular en la diferenciación de los procesos 35. Para ello, hemos integrado la microscopía de fuerza de tracción (TFM) con microarrays de células para permitir la evaluación de alto rendimiento de la tracción generada por células. TFM es un método ampliamente utilizado para medir las fuerzas de tracción generada por células y se ha proporcionado información significativa con respecto a la coordinación de una sola célula y la función a nivel de tejido con la composición y la biomecánica del microambiente local de 37, 38, 39, 40. Por lo tanto, la combinación de TFM con microarrays de células proporciona un sistema de alto rendimiento para la medición de parámetros biofísicos clave, fisiológicamente relevantes. La plataforma de microarrays de células descrito aquí consiste en cuatro secciones: la fabricación de sustratos de poliacrilamida, fabricación de matrices, cultivo de células y lectura del ensayo y análisis de los datos. VerFigura 1 para un resumen esquemático de las tres primeras secciones experimentales; véase la Figura 2 para un resumen esquemático de la sección final con un enfoque en el análisis de los datos de inmunofluorescencia. Con el fin de adaptar la plataforma de microarrays de células para estudios de las interacciones célula-sustrato biomecánicos, hemos utilizado sustratos de poliacrilamida de módulo de Young sintonizable pero porosidad similares, por Wen et al. 41. Para habilitar las mediciones de TFM fuerzas ejercidas por las células en su sustrato, se implementó un formato de placa de Petri con fondo de vidrio, además del microscopio de vidrio grueso portaobjetos de frecuencia utilizada por otros grupos. Por lo tanto, esta plataforma de microarrays célula es capaz de mediciones paralelas de diferenciación celular a través de inmunofluorescencia en portaobjetos de microscopio y las fuerzas generadas por células a través de TFM en los platos con fondo de vidrio separados. También hemos aplicado varias mejoras en el enfoque analítico empleado normalmente en los microarrays de células. ESPECÍFICOSLy, en lugar de Z-paramétrica de puntuación de la intensidad global isla, que mide la intensidad de una sola célula y aplicar cuantil normalización con el fin de dar cuenta de las distribuciones no normales y con mayor precisión describir el comportamiento celular. Creemos que estas mejoras proporcionan una utilidad particular hacia la investigación de procesos biológicos en los que las señales bioquímicas y biofísicas tanto juegan papeles importantes, que se cruzan. Además, nuestras mejoras analíticos permiten la aplicación de microarrays de células para estudios de una serie de funciones celulares para los que una sola célula y el comportamiento a nivel de población divergen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microarrays celulares microfabricados, que consisten en combinaciones de contactos impresos de biomoléculas sobre una superficie elástica hidrogel, proporcionan un alto rendimiento sistema de ingeniería estrechamente controlado para medir el impacto de las señales bioquímicas dispuestas sobre la diferenciación celular. Los esfuerzos recientes utilizando microarrays de células han demostrado su utilidad para estudios combinatorios en los que muchos factores microambientales se presentan en paralelo. Sin embargo, estos esfuerzos se han centrado principalmente en la investigación de los efectos de las señales bioquímicas en las respuestas de células. A continuación, presentamos una plataforma de microarrays de células con propiedades materiales sintonizables para evaluar tanto la diferenciación celular mediante inmunofluorescencia y célula-sustrato interacciones biomecánico mediante microscopía de fuerza de tracción. Para ello, hemos desarrollado dos formatos diferentes que utilizan hidrogeles de poliacrilamida de diferentes módulo de Young fabricado en cualquiera de portaobjetos de microscopio o platos de Petri con fondo de cristal. Proporcionamos best prácticas y reparación para la fabricación de microarrays de estos sustratos de hidrogel, el posterior cultivo de células en microarrays, y la adquisición de datos. Esta plataforma está bien adaptado para su uso en investigaciones de procesos biológicos para los que tanto bioquímica (por ejemplo, composición de la matriz extracelular) y biofísico (por ejemplo, sustrato de rigidez) señales pueden jugar significativa, la intersección de roles.

El uso de esta plataforma, se investigó el papel de ambas señales bioquímicas y biofísicas en la especificación de destino de células progenitoras del hígado 34, 35. Ligandos / Notch G conjugada con proteína A mostraron una mejor retención y la agrupación en el hidrogel de poliacrilamida (Figura 3A) y además están capaz de impulsar la diferenciación de las células progenitoras del hígado hacia un destino celular de las vías biliares (Figura 3B). Utilizando el análisis de una sola célula, que cuantifica la respuesta a los ligandos de Notch para las proteínas ECM colágeno I, colágeno III, colágeno IV, fibronectina y laminina (Figura 3C), encontrando que la respuesta de las células progenitoras del hígado al ligando depende también de la contexto ECM. Por último, hemos utilizado shRNA desmontables para generar células progenitoras del hígado sin los ligandos Dll1 y Jag1. La respuesta al ligando de Notch dispuestos variaba dependiendo del presencia de cualquiera de ligando, lo que confirma que la capacidad de respuesta al ligando de células extrínseca es también una función de la expresión de ligando de células intrínseca (Figura 3D). Además, se observó una subpoblación distinta de doble positivo (+ ALB / OPN +) células en la caída Dll1 (Figura 3D). En conjunto, estos resultados muestran representativas: (1) las capacidades combinatorias del formato de matriz, como se ejemplifica por el emparejamiento de múltiples dispuestos proteínas ECM y ligandos Notch con la caída de los ligandos individuales; (2) la funcionalidad de no sólo vistió proteínas ECM, sino también vistió ligando célula-célula a través de Proteína A conjugación / mediada por G; y (3) la aplicación de nuestro análisis de una sola célula y su capacidad de discernir las subpoblaciones únicas. También se observó que la diferenciación de células progenitoras del hígado depende tanto de la rigidez del sustrato y la composición de la MEC (Figura 4A </str<html> ong&gt;), encontrar específicamente que el colágeno IV es de apoyo de la diferenciación en ambos sustratos blandos y rígidos, mientras que la fibronectina sólo es compatible con la diferenciación en sustratos rígidos (Figura 4B). Mapas de calor representativas de las mediciones TFM sugieren que el estrés sostenido de tracción a baja rigidez sustrato sobre el colágeno IV promovió la diferenciación en células de los conductos biliares (Figura 4C), un hallazgo confirmado por los valores promedio de la raíz cuadrada media (Figura 4D). En conjunto, estos resultados muestran representativas: (1) la integración exitosa de TFM con microarrays de células en sustratos con una rigidez sintonizable para evaluar tanto el fenotipo celular y el esfuerzo de tracción; (2) la coordinación del destino de las células progenitoras hepáticas tanto con la composición de la matriz y la rigidez del sustrato; y (3) la aplicación de nuestros análisis y típicos perfiles de esfuerzo de tracción TFM en células microarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Descripción esquemática que muestra los primeros tres secciones experimentales. En la Sección 1, sustratos de vidrio se limpian y silanizada para facilitar la fabricación de hidrogeles de poliacrilamida. En la Sección 2, las combinaciones de biomoléculas de interés se preparan en una microplaca de fuente de 384 pocillos. Un arrayer robótico se carga entonces con alfileres limpias, la microplaca fuente, y los hidrogeles de poliacrilamida y se inicializa, la fabricación de matrices en los hidrogeles. En la sección 3, las células se siembran en los dominios dispuestos y permite que se adhieran, después de lo cual se realiza el protocolo de cultivo de interés. En el punto final, las células se fijan ya sea para inmunocitoquímica / inmunofluorescencia o analizados mediante TFM. Las barras de escala son 75 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> dentro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: Procesamiento y Análisis de inmunofluorescencia de datos de matrices. (A) de baldosa, compuestas imágenes RGB de 32 bits se han agrupado primero y luego divide en canales individuales de 8 bits. Usando una combinación de marcadores fluorescentes dispuestos e islas de células, se identifican tres esquinas de la matriz para permitir la orientación automatizado y cuadriculación de las matrices. (B) los datos de celda única se genera para cada canal de las matrices de entrada. Con el fin de dar cuenta de la deriva experimental, cuantil normalización se aplica mediante biológica replicar, produciendo una única distribución compartida a través de todas las repeticiones. Cuantil normalizado de datos se representa posteriormente y se interpreta a través de cálculo de las mediciones del conjunto (por ejemplo, células / isla, intensidad media, porcentaje de células positivas para una etiqueta) o el análisis directo de la distribución de una sola célula.m / archivos / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Presentación Notch ligando media la diferenciación hepática Progenitor. (A) ligandos de Notch-Fc recombinante Jagged-1 (JAG1) y Delta tipo 1 (DLL 1) exhibió una mejor retención y la agrupación cuando se vistió con proteína A / G. La barra de escala es de 50 micras. Progenitores (B) del hígado diferenciarse en células del conducto biliar mediante la presentación con el ligando de Notch. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es una etiqueta nuclear, albúmina (ALB) es un marcador de células hepáticas, y osteopontina (OPN) es un marcador de células del conducto biliar. La barra de escala es de 150 micras. (C) Cuantificación de porcentaje de células positivas para OPN para los ligandos de Notch JAG1, DLL1, y Delta-como 4 (Dll4) en las proteínas ECM colágeno I, collagen III, colágeno IV, fibronectina y laminina. T de Student pruebas se llevaron a cabo contra IgG de control para cada ligando Notch dispuestos dentro de cada proteína de ECM con P-valores indicados para p &lt;0,05 (*). (D) Imagen citometría de ALB y OPN para las células de colágeno III presentados con los ligandos Notch JAG1, Dll1, y Dll4. Células progenitoras del hígado sin la Notch ligandos Dll1 y Jag1 (es decir, shDll1 y shJag1) se generaron utilizando shRNA desmontables. Los datos en (C) presentan como media ± SEM Esta cifra ha sido modificado a partir de Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: composición de la matriz y el sustrato Rigidez Coordinate hígado Progenitor diferenciación. (A) la diferenciación de progenitores de hígado a las células del conducto biliar depende tanto de composición de la MEC y la rigidez del sustrato. DAPI es una etiqueta nuclear, ALB es un marcador de células hepáticas, y de OPN es un marcador de células del conducto biliar. (B) Cuantificación de porcentaje de células positivas para OPN sobre sustratos de módulo de Young 30 kPa, 13 kPa, y 4 kPa para el colágeno I (C1), colágeno IV (C4), fibronectina (FN), y todos de dos vías combinaciones de aquellas proteínas de ECM. (C) la tensión de tracción de la célula depende tanto de la rigidez del sustrato y la composición ECM. (D) La cuantificación de los valores de la raíz cuadrada de la media de la tensión de tracción sobre sustratos de módulo de Young de 30 kPa y 4 kPa para el colágeno I (C1), colágeno IV (C4), fibronectina (FN), y todas las combinaciones binarias de aquellos proteínas ECM. En (B) y (D), los datos se presentan como media ± SEM y t de Student-pruebasse llevaron a cabo contra 30 kPa para cada combinación de ECM con P-valores indicados para p &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), y P &lt;0,001 (***). Las barras de escala son 50 micras. Esta cifra ha sido modificado a partir de Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sección </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> Causas potenciales </td><td> Solución </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. La fabricación de poliacrilamida sustrato. </td><td> Cubreobjetos no se puede quitar de hidrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reducir el tiempo de polimerización a &lt;10 minutos (4 W / m 2). Compruebe que crossli UVnker de salida está dentro del rango esperado. </td></tr><tr><td> polimerización hidrogel de poliacrilamida pobres. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentar el tiempo de polimerización para&gt; 10 minutos (4 W / m 2). Compruebe que la salida de agente de reticulación UV está dentro del rango esperado. </td></tr><tr><td> hidrogeles de poliacrilamida se dañan después de la eliminación de cubreobjetos. </td><td> hidrogeles de poliacrilamida suaves son fáciles de dañar. </td><td> Observamos la disminución de rendimiento de hidrogel de fabricación (~ 50%) para la más suave (es decir, 4 kPa) hidrogeles en particular. Manejar hidrogeles suavemente y aumentar los números de partida para alcanzar el rendimiento deseado. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. La fabricación de matrices. </td><td rowspan="2"> la morfología del terreno pobre o inconsistente. </td><td> función de humectación inconsistente. </td><td> Compruebe que humidificador y un reómetro funcional a través de cada tirada y mantener un 65% de humedad relativa. </td></tr><tr><td> Alfileres clavados en el cabezal de impresión o estorboGED. </td><td> Limpiar el cabezal de impresión para permitir el movimiento libre de pasador. Limpiar bien los pasadores antes o después de cada tirada para eliminar los agregados de canales de espiga. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cultivo de células y Ejecución del ensayo. </td><td rowspan="2"> desprendimiento o muerte celular en matrices después de la colocación inicial. </td><td> Resiembra y la proliferación excesiva. </td><td> Reducir la densidad de siembra inicial y el tiempo. Utilice el &quot;mantenimiento&quot; o los medios de comunicación &quot;diferenciación&quot; durante el cultivo conjunto para reducir la proliferación celular. </td></tr><tr><td> La liberación de monómero de acrilamida tóxica de hidrogel. </td><td> Remojar hidrogeles en dH 2 O durante al menos 3 d para permitir la difusión / liberación de monómero de acrilamida y reducir la toxicidad celular. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Las células no se adhieren a las matrices. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentar la densidad de siembra inicial y el tiempo. Use un tipo de célula más fuertemente adherente. </td></tr><tr><td> Poor deposición dematriz o condición biomolécula. </td><td> Pasadores limpias de partículas y agregados, confirman los parámetros de impresión, y evaluar la localización de los marcadores fluorescentes, por ejemplo, dextrano conjugado con rodamina. </td></tr><tr><td> La especificidad de las interacciones célula-matriz. </td><td> Diferentes tipos de células se adhieren específicamente a algunos pero no a otras proteínas ECM. Prueba de múltiples proteínas de la ECM con sus células. </td></tr><tr><td> almacenamiento de matrices subóptima después de la fabricación. </td><td> Recomendamos almacenar matrices fabricadas durante la noche a 65% de humedad relativa y temperatura ambiente, en parte para evitar cambios de fase durante la congelación. La adhesión celular es sensible tanto a la humedad, la temperatura y tiempo de almacenamiento; asegurarse de que estos parámetros son consistentes / optimizado para sus experimentos. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Desprendimiento de hidrogel de sustrato de vidrio durante el cultivo celular. </td><td> limpieza de diapositivas pobres y silanización. </td><td> Reemplazar las soluciones de trabajo para la limpieza de diapositivas ysilanización. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hidrogel. </td><td> No deje hidrogeles de deshidratación en un plato caliente durante más de 15-30 minutos. </td></tr><tr><td> 4. Análisis de Datos. </td><td> Alta variabilidad entre los puntos en paralelo y diapositivas. </td><td> La variabilidad en la matriz de fabricación. </td><td> Compruebe que los terminales y los cabezales de impresión están limpias. Confirmar la función humidificador. Visualizar y cuantificar lugar y la matriz calidad utilizando marcadores fluorescentes. matrices de las tiendas a las recomendaciones anteriores. </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Solución de problemas.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

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Research

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Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

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The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

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Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

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