Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Vi erkänner Austin Cyphersmith och Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic biologi, University of Illinois i Urbana-Champaign) för att få hjälp med mikroskopi och generöst tillmötesgående skärm och videoinspelning vid mikroskopi kärna.

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

I våra experiment har vi funnit att de vanligaste fel är relaterade till kvaliteten på fabricerade matriser och dåligt kännetecknas respons i det biologiska systemet av intresse. Vi hänvisar läsaren till tabell 1 för gemensamma felmoder i cellmicroarray experiment och tillhörande felsökningssteg. När det gäller kvaliteten på matriser i synnerhet, rekommenderar vi följande. Bekräfta den tekniska kvaliteten och robustheten hos grupperings program, parametrar och buffertar som använder fluorescerande molekyler såsom rodamin-konjugerat dextran. Rengör stift antingen före eller efter grupperings enligt tillverkarens anvisningar och ytterligare visuellt kontrollera att stiftkanaler är fria från smuts med ett ljusmikroskop. Bekräfta klädd biomolekyler lagring med hjälp av allmänna proteinfläckar eller immunmärkning. Notera att biomolekyler med en molekylvikt under 70 kDa ofta inte kvarhålls i hydrogelen 23, </<html> sup&gt; 31. Validera klädd biomolekyler cell funktionalitet med hjälp av flera celltyper. Observera att endast vidhäftande celler är förenliga med arrayer; dessutom är vidhäftning till matriser beroende både cellspecifika egenskaper (t.ex. grin uttryck profil) och de valda ECM-proteiner. På grund av begränsat utrymme, har vi inte lämnat en omfattande behandling av array design, layout och tillverkning här och hänvisar läsaren till tidigare verk 23, 25. Vi använder i allmänhet 100 spot subsystem (150 | j, m spot diameter, 450 | im centrum-till-centrumavstånd) sammansatta av 10-20 unika biomolekyl förhållanden (dvs 5-10 fläckar / skick). Antalet subsystemen i en matris varierar beroende på antalet biomolekyler förhållanden av intresse, som kan bekvämt skalas upp till 1280 på en 25 x 75 mm objektglas (~ 6.400 platser i 64 subsystem)xref &quot;&gt; 25, 31 Parametrarna ovan kommer att ytterligare variera beroende på mönsterstorleken av intresse;. stift kan generera mönster 75-450 um är lätt tillgängliga. Array experiment bäst kompletteras med validering av höga poäng ordnade förhållanden av intresse med hjälp av andra kultur format, analys avläsning och biologiska modellsystem. Specifikt rekommenderar vi ytterligare validera effekterna av utvalda ordnade förhållanden med användning av bulk kulturer i samband med molekylärbiologiska standardtekniker (t.ex. QRT-PCR, immun) eller standard TFM. Genetisk manipulation (t.ex. knockdown eller överuttryck) av faktorn av intresse i en lämplig biologiskt modellsystem kan också användas för att bekräfta effekter som observerats i matriser. In vivo djurmodeller representerar ett annat sätt att validering och har nyligen använts, till exempel, för att bekräfta den centrala roll som galektin-3 och galektin-8 ilungcancer metastaserad nisch, som ursprungligen identifierades via cell microarray 31, 49. Ett antal andra metoder har använts för att undersöka microenvironmental reglering av cellfunktioner, inklusive en mängd två-dimensionella mikrofabricerade system 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 och tredimensionella tekniska biomaterialsystem 56, 57, 58 , 59, 60, 61. I jämförelse med andra metoder, de särskilda fördelarna med cellmicroarray plattform som beskrivs här består av: (1) genomströmning upp tillhundratals eller tusentals olika kombinationer av faktorer, som möjliggör analys av interaktionseffekter; (2) tillgänglig, automatiserad bildbehandling och analys; (3) integration av både biokemiska och biofysiska avläsning med kontrollerad presentation av ordnade faktorer; (4) förmåga att variera substratmaterialegenskaper; och (5) med hög halt encelliga analys av cellernas öde och funktion. Sammanfattningsvis kombinationen av cellarrayer med TFM på substrat av avstämbara substrat styvhet möjliggör noggrann karakterisering av både biokemiska och biofysiska signaler. Som framgår här, är denna plattform generaliserbara och kan lätt appliceras på en mängd olika vidhäftande celltyper och vävnader sammanhang mot en bättre förståelse av kombi microenvironmental reglering av celldifferentiering och mechanotransduction.

Interaktioner mellan celler och omgivande microenvironmental faktorer förmedlar en stor mängd biologiska processer i hela utveckling, homeostas och sjukdom patogenes 1, 2, 3, 4. Dessa microenvironmental interaktioner omfattar leverans av lösliga faktorer till celler, cellmatris bindning, och cell-cell-interaktioner via ligand-receptorbindning. Förutom de ovan nämnda biokemiska överväganden biofysiska parametrar, såsom substrat mekaniska egenskaper (t.ex., Youngs modul, porositet) och cellform, och de associerade nedströms mechanotransduction har alltmer vunnit erkännande som viktiga mediatorer av celldifferentiering 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Signaler till följd av dessa microenvironmental interaktioner tjänar som insignaler till gennätverk och signalvägar. Dessutom är dessa cell inneboende komponenterna ger också återkoppling till mikromiljön via utsöndrade faktorer och matrisnedbrytande enzymer, som kompletterar en komplex samreglerande slinga mellan cell inneboende genetiska program och cell-extrinsic microenvironmental faktorer 5, 11, 12. Användning av konstruerade system för den kontrollerade presentation av microenvironmental faktorer har visat sig vara användbara i en rad olika sammanhang 13, 14, 15. Mikrofabricerade system i synnerhet har underlättat exakt rumslig mönstring av proteiner och celler samt mycket parallelliserad analys via miniatyrisering 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Cellarrayer representerar en sådan mikrofabricerade system där kombinationer av biomolekyler är kontakt tryckt på en elastisk polyakrylamid hydrogel substrat 23, 24, 25. Införandet av cell lim komponenter (nämligen matrixproteiner) möjliggör varaktig celladhesion och kultur på mikroarrayer, som ofta följs av nedströms analys via immunocytokemi och fluorescerande reportrar. Cellarrayer har produktivt inriktad uppnå en ökad förståelse av lever cellfenotyp 23, 26, neurala föregångare differentiering 27, mammary stamfader öde beslut 28, embryonala stamceller underhåll / differentiering 23, 29, 30, lungcancer metastaser 31 och terapeutiskt svar i melanom 32. Vi har nyligen visat att användningen av cellarrayer för definitionen av extracellulär matrix (ECM) proteinkomposition i endoderm specifikation 33, lever progenitor differentiering 34, 35, och lungtumörcellläkemedelssvar 36. I dessa verk, har vi fokuserat på att utvidga kombi funktionerna i uppsättningen plattformen och utforska korsningar av cell inneboende signalering med extracellulära matriskomposition och biomekanik. Dessutom har vi genomfört biofysikaliska avläsning i denna array plattform för att ge möjlighet att kvantitativt känneterize roll cellkontraktilitet i differentieringsprocesser 35. För att göra detta, integrerade vi dragkraft mikroskopi (TFM) med cellarrayer för att möjliggöra hög genomströmning bedömning av cell-genererade dragkraft. TFM är en allmänt används metod för att mäta cell genererade dragkrafter och har gett betydande insikter om samordning av encelliga och vävnadsnivå funktion med sammansättningen och biomekanik den lokala mikro 37, 38, 39, 40. Således kombinerar TFM med cellarrayer ger en hög genomströmning system för mätning av nyckel, fysiologiskt relevanta biofysiska parametrar. Cellmicroarray plattform som beskrivs här består av fyra delar: tillverkning av polyakrylamid substrat, tillverkning av matriser, cellodling och analys avläsning och analys av data. SeFigur 1 för en schematisk sammanfattning av de tre första experimentella sektioner; se figur 2 för en schematisk sammanfattning av det sista avsnittet med fokus på analys av immunfluorescensdata. För att anpassa cellen microarray plattform för att studier av biomekaniska cellsubstratinteraktioner, använde vi polyakrylamid substrat av avstämbar Youngs modul men liknande porositet, per Wen et al. 41. Att göra det möjligt TFM mätningar av krafter som utövas av celler på deras substrat, genomförde vi en glasbottnad petriskål format utöver den tjocka glasobjektglas ofta utnyttjas av andra grupper. Således är denna cell microarray plattform kan parallella mätningar av celldifferentiering via immunofluorescens på objektglas och cellgenererade styrkor via TFM på separata glasbottnade rätter. Vi har också tillämpas flera förbättringar av analytisk metod som vanligen används med cellarrayer. Specifically, i stället för parametrisk Z-poäng av totalt ö intensitet, mäter vi encelliga intensitet och tillämpa -kvantilen normalisering för att ta hänsyn till icke-normala fördelningar och mer exakt beskriva cellulära beteende. Vi anser att dessa förbättringar ge särskild användbarhet mot undersökningar av biologiska processer där både biokemiska och biofysiska signaler spelar betydande, korsande roller. Vidare våra analys förbättringar möjliggör tillämpningen av cellarrayer studier av en rad cellulära funktioner som encelliga och populationsnivå beteende avviker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Mikrofabricerade cell mikroarrayer, som består av kontakt tryckta kombinationer av biomolekyler på ett elastiskt hydrogel yta, ger en hårt kontrollerad, hög genomströmning konstruerad system för att mäta effekten av ordnade biokemiska signaler på celldifferentiering. Nya ansträngningar använder cellarrayer har visat sin användbarhet för kombistudier där många microenvironmental faktorer presenteras parallellt. Emellertid har dessa ansträngningar främst fokuserat på att undersöka effekterna av biokemiska signaler på cellsvar. Här presenterar vi en cell microarray plattform med avstämbara materialegenskaper för att utvärdera både celldifferentiering genom immunofluorescens och biomekanisk cellsubstratinteraktioner genom dragkraft mikroskopi. För att göra detta, har vi utvecklat två olika format som använder polyakrylamid hydrogeler med varierande Youngs modul tillverkas på antingen objektglas eller glasbottnade petriskålar. Vi tillhandahåller best metoder och felsökning för tillverkning av microarrays på dessa hydrogel substrat, den efterföljande cellodling på mikroarrayer, och förvärvet av data. Denna plattform är väl lämpad för användning i undersökningar av biologiska processer där både biokemiska (t.ex. extracellulära matriskomposition) och biofysikalisk (t.ex. substrat styvhet) kan ledtrådar spela betydande korsande roller.

Med hjälp av denna plattform, undersökte vi rollen av både biokemiska och biofysiska ledtrådar i öde specifikation av leverstamfäder 34, 35. Protein A / G-konjugerad Notch-ligander visade förbättrad retention och klustring i polyakrylamid hydrogel (Figur 3A) och var dessutom kapabel att driva differentiering av leverstamfäder mot en gallgången cell öde (Figur 3B). Med hjälp av encelliga analys, vi kvantifierat svar på Notch-ligander för ECM-proteiner kollagen I, kollagen III, kollagen IV, fibronektin och laminin (figur 3C), fann att svaret av leverstamfäder till liganden beror också på ECM sammanhang. Slutligen utnyttjade vi shRNA knockdown att generera leverstamfäder utan ligandema Dll1 och JAG1. Gensvaret på klädd Notch-ligand varierade beroende på presence antingen ligand, vilket bekräftar att responsen för cell yttre liganden är också en funktion av cell inneboende ligand uttryck (Figur 3D). Vidare observerade vi en tydlig subpopulation av dubbelpositiva (ALB + / OPN +) celler i Dll1 knockdown (Figur 3D). Tillsammans utgör dessa representativa resultat visar: (1) de kombi kapacitet arrayformat, som exemplifieras av hopkopplingen av flera klädd ECM-proteiner och Notch-ligander med knockdown av enskilda ligander; (2) funktionalitet inte bara klädd ECM-proteiner utan också klädd cell-cell-ligand via protein A / G-medierad konjugation; och (3) genomförandet av vår encelliga analys och dess förmåga att urskilja unika subpopulationer. Vi observerade också att differentieringen av leverstamfäder är beroende av både substratet styvhet och ECM sammansättning (figur 4A </str<html> ong&gt;), särskilt konstatera att kollagen IV stöder differentiering på både mjuka och styva substrat medan fibronektin stöder endast differentiering på styva substrat (Figur 4B). Representativa värme kartor över TFM mätningar tyder på att ihållande dragkraft stress i låg substrat styvhet på kollagen IV främjade differentiering till galla kanalceller (Figur 4C), ett konstaterande bekräftas av genomsnittliga root-mean-square värden (Figur 4D). Tillsammans utgör dessa representativa resultat visar: (1) en framgångsrik integration av TFM med cellarrayer på substrat med en avstämbar styvhet för att bedöma både cellfenotyp och driv stress; (2) samordning av levern progenitorcell öde med både matriskompositionen och substratet styvhet; och (3) genomförandet av våra TFM analys och typiska dragspännings profiler i cellarrayer. e en &quot;src =&quot; / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Översikt schema som visar de tre första Experimentella avsnitt. I avsnitt 1, är glassubstrat rengörs och silaniserad för att underlätta tillverkning av polyakrylamid hydrogeler. I avsnitt 2, är biomolekylen kombinationer av intresse ställdes i en 384 brunnar källmikro. En robot arrayer laddas sedan med rena nålar, källmikro, och polyakrylamid hydrogeler och initieras, tillverka matriser på hydrogel. I avsnitt tre celler såddes på de grupperade domäner och fick fästa, varefter kulturen protokollet av intresse utförs. Vid slutpunkten, celler antingen fastställts för immuncytokemi / immunofluorescens eller analyseras med hjälp av TFM. Skala barer är 75 pm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> inom-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figur 2: bearbetning och analys av Immunofluorescens Data från arrayer. (A) Klinker, sammansatta 32-bitars RGB-bilder först arkiveras och sedan upp i flera enskilda 8-bitars kanaler. Med användning av en kombination av grupperade fluorescerande markörer och cell öar, är tre hörnen i arrayen identifieras för att möjliggöra för automatiserad orientering och gridding av de matriser. (B) Single-cell data genereras för varje kanal av inmatnings arrayer. För att redogöra för experimentell drift, är -kvantilen normalisering tillämpas av biologisk replikat, som producerar en enda gemensam spridning över alla replikat. -kvantilen Norm därefter plottas och tolkas genom beräkning av ensemble mätningar (t.ex. celler / ö, medelintensitet, procentenheter celler positivt för en etikett) eller direkt analys av encelliga distributioner.m / filer / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figur 3: Notch ligand Presentation förmedlar Lever gångar differentiering. (A) Fc-rekombinant Notch ligander Jagged-1 (JAG1) och Delta-like en (DLL1) uppvisade förbättrad retention och klustring när klädd med protein A / G. Skala bar är 50 pm. (B) Lever stamceller differentieras till galla kanalceller vid uppvisande med Notch-ligand. 4 &#39;, är 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) en nukleär märkning, albumin (ALB) är en levercellmarkör, och osteopontin (OPN) är en gallgången cellmarkör. Skala bar är 150 pm. (C) Kvantifiering av den procentuella andelen celler positivt för OPN för Notch-ligander JAG1, DLL1, och Delta-like 4 (DLL4) på ECM-proteiner kollagen I, collagen III, kollagen IV, fibronektin och laminin. Students t -tests utfördes mot kontroll-IgG för varje klädd Notch-ligand inom varje ECM protein med P-värden anges för P &lt;0,05 (*). (D) Imaging cytometry av ALB och OPN för celler på kollagen III presenteras med Notch-ligander JAG1, DLL1 och DLL4. Leverstamfäder utan Notch liganderna Dll1 och JAG1 (dvs shDll1 och shJag1) genererades med användning shRNA knockdown. Data i (C) presenteras som medelvärde ± sem Denna siffra har modifierats Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figur 4: Matrix sammansättning och substrat Stelhet Coordinate Liver progenitor Differentiering. (A) Lever progenitor differentiering till gallgångsceller celler är beroende av både ECM sammansättning och substrat styvhet. DAPI är en nukleär märkning, ALB är en levercellmarkör, och OPN är en gallgången cellmarkör. (B) Kvantifiering av procentandelen av celler positiva för OPN på substrat av Youngs modul 30 kPa, 13 kPa, och 4 kPa för kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), och alla två-vägs kombinationer av dessa ECM-proteiner. (C) Cell dragkraft stress är beroende av både substrat styvhet och ECM sammansättning. (D) Kvantifiering av root-mean-square värden för dragspänning på substrat av Youngs modul 30 kPa och 4 kPa för kollagen I (C1), kollagen IV (C4), fibronektin (FN), och alla tvåvägs kombinationer av de ECM-proteiner. I (B) och (D), samlades data presenteras som medelvärde ± SEM och Students t -testsutfördes mot 30 kPa för varje ECM kombination med P-värden anges för P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) och P &lt;0,001 (***). Skala barer är 50 pm. Denna siffra har modifierats Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sektion </td><td fo:width="1.5in"> Problem </td><td fo:width="1.5in"> potentiella orsaker </td><td> Lösning </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Tillverkning av Polyacrylamide Substrate. </td><td> Coverglass kan inte tas bort från hydrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reducera polymerisationstiden till &lt;10 minuter (4 W / m 2). Kontrollera att UV crosslinker utsignal ligger inom förväntat intervall. </td></tr><tr><td> Dålig polyakrylamid hydrogel polymerisation. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Öka polymerisationstiden till&gt; 10 minuter (4 W / m 2). Kontrollera att UV-tvärbindare produktionen är inom förväntade intervall. </td></tr><tr><td> Polyakrylamid hydrogeler är skadade efter avlägsnande av coverglass. </td><td> Mjuka polyakrylamid hydrogeler är lätt att skada. </td><td> Vi observerar minskar hydrogel tillverkning avkastning (~ 50%) för den mjukaste (dvs 4 kPa) hydrogeler i synnerhet. Hantera hydrogeler försiktigt och öka startnummer för att uppnå önskad avkastning. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Tillverkning av matriser. </td><td rowspan="2"> Dålig eller inkonsekvent plats morfologi. </td><td> Inkonsekvent luftfuktare funktion. </td><td> Kontrollera att luftfuktare och Rheometer en funktionell under varje upplaga och behålla 65% RH. </td></tr><tr><td> Stift fastnat i skrivhuvudet eller täppaged. </td><td> Rengör skrivhuvudet för att möjliggöra fri stift rörelse. Rena stift noggrant före eller efter varje upplaga för att avlägsna aggregat från stiftkanaler. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cell Culture och analys Execution. </td><td rowspan="2"> Cell lossnar eller död på matriser efter initial fastsättning. </td><td> Overseeding och överdriven proliferation. </td><td> Minska initial sådd densitet och tid. Använd &quot;underhåll&quot; eller &quot;differentiering&quot; media under array kultur för att minska celltillväxt. </td></tr><tr><td> Frisättning av toxiska akrylamidmonomer från hydrogel. </td><td> Blöt hydrogeler i dH 2 O i minst 3 d för att medge diffusion / frisättning av akrylamidmonomer och minska celltoxicitet. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Celler inte fäster matriser. </td><td> Underseeding. </td><td> Öka initial sådd densitet och tid. Använda en mer starkt vidhäftande celltypen. </td></tr><tr><td> Dålig avsättning avmatris eller biomolekyl tillstånd. </td><td> Rena stift av partiklar och aggregat, bekräfta utskriftsparametrar och utvärdera observation av fluorescerande markörer, t.ex. rodamin-konjugerat dextran. </td></tr><tr><td> Specificiteten för cell-matrix-interaktioner. </td><td> Olika celltyper vidhäftar specifikt till vissa men inte andra ECM-proteiner. Testa flera olika ECM-proteiner med dina celler. </td></tr><tr><td> Suboptimal array lagring efter tillverkning. </td><td> Vi rekommenderar lagring av fabricerade arrayer över natt vid 65% relativ fuktighet och rumstemperatur, delvis för att undvika fasändringar under frysning. Celladhesion är känslig för både fuktighet, temperatur och lagringstid; Se till att dessa parametrar är konsekventa / optimerad för dina experiment. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Avlossning av hydrogel från glassubstratet under cellodling. </td><td> Dålig glid rengöring och silanisering. </td><td> Byt arbetslösningar för glid rengöring ochsilanisering. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hydrogel. </td><td> Lämna inte hydrogeler uttorkande på en värmeplatta under längre tid än 15-30 minuter. </td></tr><tr><td> 4. Analys av data. </td><td> Hög variation mellan upprepade fläckar och diabilder. </td><td> Variationen i array tillverkning. </td><td> Kontrollera att stiften och skrivhuvudet är rena. Bekräfta luftfuktare funktion. Visualisera och kvantifiera plats och array kvalitet med fluorescerande markörer. Lagra matriser som rekommenderas ovan. </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Felsökning.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Celldifferentiering är reglerad av en mängd microenvironmental faktorer, bland annat båda matriskomposition och substratmaterialegenskaper. Vi beskriver här en teknik som utnyttjar cellarrayer jämförd med dragkraft mikroskopi för att utvärdera både celldifferentiering och biomekaniska cell-substratinteraktioner som en funktion av microenvironmental sammanhang.

En hög kapacitet Cell microarray plattform för Korrelat analys av celldifferentiering och dragkrafter

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Hög genomströmning MikroRNA Profilering: Optimerad Multiplex QRT-PCR vid metod i nanoliter Skala på Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Hög genomströmning Single-cell och flera celler mikroinkapsling

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelat mikroskopi för 3D Strukturell Analys av dynamisk samverkan

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En mångsidig automatiserad plattform för mikroskala Experiment cellstimulering

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching plattform för tillämpningar inom cell-och vävnads mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metod för att lokalisera Reporter Fluorescent Pärlor Nära Cell Culture Yta för Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En mikroflödessystem plattform för hög genomströmning Single-cell isolering och kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...