Name: a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

Biz kabul Austin Cyphersmith ve Mayandi Sivaguru (Genomik Biyoloji Carl R. Woese Enstitüsü, University of Illinois at Urbana Champaign) mikroskobu ile yardım için ve cömertçe mikroskopi özünde ekran ve video çekimi barındırmak için.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Deneylerde, biz en yaygın hataları uydurma dizilerin kalitesi ile ilgili ve kötü ilgi biyolojik sistem yanıtı karakterize bulduk. Biz cep mikroarray deneylerde yaygın arıza modları ve ilişkili sorun giderme adımları için Tablo 1&#39;de okuyucu bakın. Özellikle dizilerin kalitesiyle ilgili, biz aşağıdaki öneriyoruz. Böyle rodamin-konjuge dekstran gibi floresan etiketli molekülleri kullanarak programları parametreler ve tamponlar arraying teknik kalite ve sağlamlığı onaylayın. önce ya da daha fazla görsel üreticinin talimatlarına göre arraying ve sonra ya tamamen temiz pimleri pim kanalları ışık mikroskobu kullanılarak enkaz açık olup olmadığını kontrol edin. genel protein lekeleri veya immün kullanarak dizilmiş biyomolekül tutma onaylayın. 70 kDa altında bir moleküler ağırlığa sahip biyomoleküller sık hidrojel 23 korunmaz unutmayın </<html> sup&gt; 31. Birden fazla hücre tiplerini kullanarak dizilmiş biyomolekül hücre işlevselliğini doğrulamak. Sadece yapışık hücreler diziler ile uyumlu olduğunu unutmayın; Buna ek olarak, diziler kaynaşmasının hücreye özel özellikleri (örneğin, integrin ifade profili) ve seçilen ECM proteinleri bağlıdır. Sınırlı yer nedeniyle, burada dizi tasarım, düzen ve imalat geniş bir tedavi verilmez ve daha önceki 23 çalışır için, 25 okuyucu bakın. Biz genel olarak 10-20 benzersiz biyomolekül koşulları (yani, 5-10 noktalar / durumu) oluşan 100 nokta Altdizilim (150 mikron nokta çapı 450 mikron merkez-merkez mesafesi) kullanın. bir dizide altdizilimlerden sayısı rahatça biri 25 × 75 mm mikroskop lamı üzerine 1,280 kadar ölçeklendirilebilir ilgi biyomolekül koşulları sayısına bağlı olarak değişir (~ 64 altdizilimlerden içinde 6.400 noktalar)xref &quot;&gt; 25, 31 parametre üzerinde daha fazla ilgi desen boyutuna bağlı olarak değişir;. 75 desen üretme kapasitesine sahip pimleri - 450 mikron kolayca kullanılabilir. Dizi deneyler en iyi diğer kültür biçimlerini kullanarak yüksek faiz-puanlama dizilmiş koşulları, tahlil okumalara ve biyolojik model sistemleri doğrulama ile tamamlanmaktadır. Spesifik olarak, daha ayrıntılı bir şekilde, standart moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, QRT-PCR, immün) veya standart TFM ile bağlantılı dökme kültürleri kullanılarak seçme dizilmiş koşullarının kanıtlayan önerilir. Genetik manipülasyon Ayrıca diziler gözlenen etkileri onaylamak için hizmet, uygun bir biyolojik model sisteminde ilgi faktörünün (örneğin, demonte veya aşırı ifadesi). In vivo hayvan modelleri doğrulama başka bir yöntem temsil en son galektin-3 ve galektin-8 merkezi rolü teyit etmek için, örneğin, kullanılanAkciğer kanseri metastatik niş, başlangıçta hücre mikroarray 31 49 aracılığıyla belirledi. Diğer bir dizi yöntem, iki boyutlu bir mikrofabrike sistemleri 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ve üç boyutlu tasarlanmış biyomalzeme sistemleri 56, çeşitli 57, 58 dahil olmak üzere, hücresel fonksiyonları microenvironmental düzenleme, problamak için kullanılmıştır , 59, 60, 61. diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada tarif edilen hücre mikrodizi platformun özel avantajlar oluşur: (1) ila yukarı çıktıyüzlerce veya etkileşim etkilerinin analizi sağlayan faktörlerin farklı kombinasyonları, binlerce; (2) erişilebilir, otomatik görüntüleme ve analizi; (3) dizilmiş faktörlerin kontrollü sunumu ile hem biyokimyasal ve biyofiziksel okumalarla entegrasyonu; (4) alt-tabaka malzemesi özellikleri değiştirme yeteneğini de; hücre kaderinin ve fonksiyonu ve (5) yüksek içeriği tek hücre analizi. Özetle, ayarlanabilir alt tabaka sertliği yüzeylerde TFM hücre microarrays kombinasyonu hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Burada görüldüğü gibi, bu platform genellenebilir ve hali hazırda hücre farklılaşması ve mechanotransduction kombinatoryal mikro-çevresel bir düzenleme daha iyi anlaşılması doğru yapışık hücre tipleri ve doku çeşitli bağlamlarda da uygulanabilir.

Hücre ve çevresindeki mikro-çevresel faktörler arasındaki etkileşimler geliştirme, homeostaz ve hastalığın patojenezi, 1, 2, 3, 4 boyunca biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik aracılık eder. Bu mikro-çevresel etkileşimler ligand-reseptörü aracılığıyla hücrelere çözünür faktörlerin teslim bağlayıcı hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri bulunmaktadır. Yukarıda biyokimyasal açıdan ek olarak, bu tür alt-tabaka mekanik özellikleri biofiziksel parametreleri (örneğin, Young modülü, gözeneklilik) ve hücre şekli ve ilişkili alt mechanotransduction artan hücre farklılaşması 5, 6, 7, 8, anahtar aracılar olarak tanındı adres 9 <sup&gt; 10. Bu microenvironmental etkileşimler kaynaklanan sinyaller gen ağları ve sinyal yolları girdi olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, bu hücre iç bileşenler aynı zamanda hücre hakiki genetik programlar ve hücre dış mikro-çevresel faktörlerin 5, 11, 12 arasındaki karmaşık eş düzenleyici döngü tamamlayan salgılanan faktörler ve matris-parçalayıcı enzimler yoluyla mikro geri bildirimde bulunur. Mikro-çevresel faktörler tarafından kontrol edilen sunum için tasarlanmış sistemlerinin kullanımı farklı bağlamlarda 13, 14, 15, bir dizi yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle mikrofabrike sistemleri, minyatürleştirme 13 ile protein ve hücreleri hem de yüksek paralelleştirilmiş analiz hassas mekansal model oluşturmanın kolaylaştırmıştır <supSınıf = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Hücre mikrodizileri biyomoleküllerin kombinasyonları iletişim baskılı bir esnek poliakrilamid hidrojel alt-tabaka 23, 24, 25 üzerine olan bu tür bir mikrofabrike sistemi temsil eder. Hücre-yapışkan bileşenlerin (yani matriks proteinleri) dahil sık sık immünsitokimya ve floresan gazetecilere yoluyla aşağı analizi ile takip edilmektedir mikrodizinlerinde sürekli hücre yapışması ve kültürünü mümkün kılar. Hücre mikroarray&#39;ler verimli karaciğer hücre fenotip 23, 26, nöral prekürsör farklılaşma 27 mammar geliştirilmiş bir anlayış elde yönelik edilmiştiry progenitör kader kararları 28, embriyonik kök hücre bakım / farklılaşma 23, 29, 30, akciğer kanseri metastazı 31 ve melanom 32 tedavi yanıtı. Son zamanlarda endoderm tarifnamede 33, karaciğer progenitör farklılaşma 34, 35, ve akciğer tümör hücre tedaviye yanıt 36 hücre dışı matris (ECM) protein bileşiminin rolünü tanımlamak için hücre mikrodizileri kullanımını göstermiştir. Bu çalışmalarda, biz dizi platformunun kombinasyon yeteneklerinin artırılması ve hücre dışı matriks kompozisyonu ve biyomekanik ile hücre içsel sinyalizasyon kavşakları keşfetmeye odaklanmıştır. Ayrıca, yetenek kantitatif şekilde karakterize sağlamak için bu dizi platformda biyofizik readouts hayata geçirdikfarklılaşma hücre kontraktilite terize rolü 35 işler. Bunu yapmak için, biz hücre tarafından üretilen çekiş yüksek verimlilik değerlendirilmesini sağlamak için hücre mikroarray&#39;ler ile çekme kuvvet mikroskobu (TFM) entegre edilmiştir. TFM hücresi tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, bileşim ve yerel mikro-37, 38, 39, 40 biyomekanik tek-hücre ve doku düzeyinde işlev koordinasyonu ile ilgili önemli bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, hücre mikrodizileri ile TFM birleştiren temel fizyolojik olarak uygun biofiziksel parametreleri ölçmek için yüksek verimli bir sistem sağlar. Burada anlatılan hücre mikroarray platformu dört bölümden oluşmaktadır: poliakrilamid yüzeylerde, diziler, hücre kültürü ve tahlil okuma üretiminde ve verilerin analizi imalatı. Görmekİlk üç deney bölümleri şematik özeti Şekil 1 &#39;dir; immünofloresan verilerin analizi odaklanarak son bölümde bir şematik özeti için bakınız Şekil 2. Biyomekanik hücre alt-tabaka etkileşim çalışmalar hücre mikrodizi platformu adapte amacıyla, Wen et al başına ayarlanabilir Young modülü ama benzer gözenekli poliakrilamid substratlar kullanılır. 41. onların alt tabaka üzerinde hücreler tarafından uygulanan kuvvetlerin TFM ölçümleri etkinleştirmek için, biz sık sık diğer gruplar tarafından kullanılan slaytlar kalın cam mikroskop ek olarak cam alt Petri kabı biçimi uyguladı. Bu nedenle, bu hücre mikrodizi platformu ayrı cam alt yemekler TFM ile mikroskop lamı ve hücre tarafından üretilen kuvvetlerin immünofloresan ile hücre farklılaşmasının paralel ölçümler yeteneğine sahiptir. Biz de yaygın hücre mikroarray&#39;ler ile kullanılan analitik yaklaşıma çeşitli iyileştirmeler uyguladık. Özelly, yerine genel ada yoğunluğu parametrik Z-puanlama, biz tek hücreli yoğunluğunu ölçmek ve normal olmayan dağılımlar için hesap ve daha doğru hücresel davranışını tanımlamak için kantil normalleşme uygulayın. Biz bu gelişmeler biyokimyasal ve biyofiziksel hem ipuçları önemli, kesişen rol oynadığı biyolojik süreçlerin araştırılması yönünde özellikle yarar sağladığına inanıyoruz. Ayrıca, bizim analitik gelişmeler tek hücreli ve nüfus seviyesi davranışı sapmak hangi hücresel fonksiyonları bir dizi çalışmalara hücre mikroarray&#39;ler uygulanmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

elastik hidrojel yüzeyinde biyomoleküllerin temas baskılı kombinasyonları oluşur microfabricated hücresel mikroarray&#39;ler, hücre farklılaşması üzerine dizilmiş biyokimyasal sinyallerin etkisini ölçmek için bir sıkı kontrol, yüksek verimli mühendislik sistem sağlamak. Hücre mikrodiziler kullanarak Son çalışmalar, birçok microenvironmental faktör paralel olarak sunulduğu kombinasyon çalışmaları için kendi programını ortaya koymuştur. Ancak bu çabalar hücre yanıtları biyokimyasal ipuçlarının etkilerini araştıran öncelikle odaklanmıştır. Burada, çekiş kuvveti mikroskobu ile immünofloresan ve biyomekanik hücre-substrat etkileşimleri hem hücre farklılaşması değerlendirmek için ayarlanabilir malzeme özelliklerine sahip bir cep mikroarray platformu sunuyoruz. Bunu yapmak için, biz ya mikroskop lamı veya cam alt Petri kapları üzerinde fabrikasyon Young modülü değişen poliakrilamid hidrojeller kullanan iki farklı biçimleri geliştirmişlerdir. Biz bes sağlamakBu hidrojel yüzeylerde microarrays imalat, mikrodizinlerinde sonraki hücre kültürü ve veri edinimi için t uygulamaları ve sorun giderme. Bu platform da biyokimyasal (örneğin, hücre dışı matris bileşimi) hem ve biyofiziksel (örneğin, alt-tabaka sertliği) işaretler rolleri kesişen önemli oynayabilir biyolojik proseslerin incelenmesi kullanılmak için çok uygundur.

Bu platformu kullanarak, karaciğer atalarıdır 34, 35 kaderi şartnamede hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının rolünü araştırdık. Protein A / G-konjuge Çentik ligandlan poliakrilamid hidrojel (Şekil 3A), geliştirilmiş saklama ve kümelenme gösterdi ve safra kanalı, hücre kaderine (Şekil 3B) doğru karaciğer progenitörlerin farklılaşmasını sürüş Ayrıca sahip idi. Tek hücreli bir analiz kullanarak, liganda karaciğer progenitörlerinin tepkisi de bağlıdır bulgu, ECM proteinleri kolajen I, kolajen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin (Şekil 3C) çentik ligandlarına yanıt sayısal ECM bağlam. Son olarak, ligandlar DLL1 ve Jag1 olmadan karaciğer atalarıdır oluşturmak için ShRNA demonte kullanılmaktadır. dizilmiş Notch bağına yanıt pr bağlı olarak değişiklikHer iki ligandın özünü, hücre dışsal liganda yanıt hücre iç ligand ifade (Şekil 3D) bir fonksiyonu da doğrular. Dahası, çift pozitif bir tat alt popülasyonunu gözlenmiştir (ALB + / OPN +) DLL1 demonte (Şekil 3D) hücreler. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) tek tek ligandların devirme ile birden dizilmiş ECM proteinleri ve Çentik ligand eşleştirme ile gösterildiği üzere bir dizi formatı kombinasyon yetenekleri; (2) sadece bir işlevi ECM proteinlerini dizilmiş değil, aynı zamanda protein A / G-aracılı birleştirme aracılığı ile hücre-hücre ligand dizilmiş; ve (3) bizim tek hücreli analizi ve benzersiz alt popülasyonlar ayırt etme yeteneği uygulanması. Ayrıca karaciğer progenitörlerinin farklılaşma alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimi (Şekil 4a, her iki bağımlı olduğu görülmektedir </str<html> fibronektin sadece sert yüzeylerde (Şekil 4B) üzerinde farklılaşma desteklerken ong&gt;), özellikle kolajen IV bulma hem yumuşak ve sert yüzeylerde farklılaşma destekleyicidir. TFM ölçümlerinin Temsilcisi ısı haritaları kollajen IV düşük substrat sertliği de sürekli çekiş stres safra yolu hücreleri (Şekil 4C), ortalama kök ortalama kare değerleri (Şekil 4D) tarafından teyit bir bulgu haline farklılaşmayı teşvik önerdi. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) bir ayarlanabilir sertlik yüzeylerde hücre mikroarreyleri ile TFM başarılı entegrasyon hücre fenotipi ve çekiş stres hem değerlendirmek için; (2) matris bileşimi ve alt tabaka sertlik hem karaciğer progenitör hücre kaderinin koordinasyonu; ve (3) hücre mikrodizilerinde bizim TFM analizi ve tipik bir gerilim profillerini uygulanması. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: İlk Üç Deneysel Bölümler gösteriliyor Özet şematik. Bölüm 1, cam yüzeylerde temizlenmeli ve poliakrilamid hidrojeller fabrikasyon kolaylaştırmak için Silanlanmış edilir. Bölüm 2&#39;de, ilgi konusu biyomolekülün kombinasyonları 384 kaynağı mikro-hazırlanır. Bir robot arrayer sonra hidrojeller üzerinde diziler imalatı, temiz pimleri, kaynak mikroplaka ve poliakrilamid hidrojeller ile yüklenir ve başlatılır. Bölüm 3, hücreler dizilmiş alan üzerine ekilip ilgi kültür protokolü uygulandı, bundan sonra, uygun izin verilir. uç noktada, hücreler ya TFM kullanarak immünsitokimya / Immünofloresan için sabit veya analiz edilir. Ölçek çubukları 75 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> = &quot;1&quot;&gt; sayfa içinde <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Şekil 2: İşleme ve Diziler gelen İmmünofloresan Verilerin Analizi. (A) Karo, kompozit 32 bit RGB görüntüleri ilk binned ve daha sonra tek tek 8-bitlik kanallara ayrılır. dizilmiş floresan belirteçler ve hücre adaların bir arada kullanarak, dizinin üç köşesi otomatik yönlendirme ve dizilerin gridding sağlamak için belirlenmiştir. (B) tek-hücreli veri giriş dizilerinin her kanal için oluşturulur. Deneysel sürüklenme hesaba amacıyla, kantil normalleştirme tüm çoğaltır genelinde tek bir paylaşılan dağıtım üreten, biyolojik tekrarında uygulanır. Quantile normalize veri sonradan ya da tek hücreli dağılımlarının doğrudan analizi (bir etiket için pozitif yüzde hücre yoğunluğu ortalama örneğin, hücre / ada) çizilen ve topluluk ölçümlerinin hesaplanması yoluyla yorumlanır.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Şekil 3: Notch Ligand Sunum Aracılık Karaciğer Progenitör Farklılaşma. (A) Fc-rekombinant Çentik ligandları Jagged-1 (JAG1) ve Delta gibi 1 (DLL1) Protein A / G ile dizilmiş gelişmiş tutma ve kümelenme sergiledi. Ölçek çubuğu 50 mm. (B) Karaciğer ataları Notch ligand ile ibrazı üzerine safra yolu hücrelerine diferansiye. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer bir etiket, albümin (ALB) bir karaciğer hücre belirteci olduğu ve osteopontin (APN) olan bir safra kanalı, hücre belirtecidir. Ölçek çubuğu 150 mm. (C) ECM proteinleri üzerinde çentik ligandlar JAG1, DLL1 ve Delta gibi 4 (DLL4) için APN için pozitif hücrelerin yüzdesi miktarının belirlenmesi I kollajenin, collagen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin. Student t-test P &lt;0.05 (*) için belirtilen P-değerleri, her ECM proteininde içinde her dizilmiş Çentik ligand için kontrol IgG karşı yapıldı. Notch ligandları JAG1, DLL1 ve DLL4 mevcuttur kollajen III hücreler için ALB ve APN (D) Görüntüleme sitometri. Çentiksiz karaciğer progenitörler DLL1 ve Jag1 (yani, shDll1 ve shJag1) shRNA demonte kullanılarak elde edilmiştir ligandları. Ortalama ± sem Bu rakam Kaylan&#39;ın ark tadil edilmiş olduğu (C) &#39;de veriler sunmuşlardır. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Şekil 4: The Matrix Kompozisyon ve Yüzey Sertlik CooKaraciğer Progenitör Farklılaşma rdinate. Kanal hücreleri safra (A) Karaciğer progenitör farklılaşma ECM kompozisyon ve alt tabaka sertlik hem bağlıdır. DAPI ALB bir karaciğer hücre işaretleyici ve APN bir safra kanalı, hücre işaretleyici, nükleer bir etikettir. (B) Young modülü alt tabakalar 30 kPa, 13 kPa, kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve iki yönlü kombinasyonları ile ilgili APN için pozitif hücrelerin yüzdesi kantifikasyonu bu ECM proteinleri. (C) Celi bir gerilim alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimin hem bağlıdır. (D) Young modülü alt tabakalar 30 kPa ve kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve bu her iki yollu kombinasyonları, çekiş stres kök-ortalama-kare değerlerinin miktarının belirlenmesi ECM proteinleri. (B) ve (D) &#39;de, veriler SEM ve Student t-test, ortalama ± olarak sunulduP &lt;0.05 (*) p &lt;0.01 (**) için belirtilen P-değerleri, her ECM kombinasyonu için 30 kPa karşı gerçekleştirilen edildi ve p &lt;0.001 (***). Ölçek çubukları 50 mikron. Bu rakam Kourouklis ark modifiye edilmiştir. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Bölüm </td><td fo:width="1.5in"> Sorun </td><td fo:width="1.5in"> potansiyel Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Poliakrilamid Yüzey 1. Fabrikasyon. </td><td> Coverglass hidrojelden kaldırılamaz. </td><td> Overpolymerization. </td><td> &lt;10 dakika (4 W / m 2) polimerizasyon süresini azaltın. UV crossli kontrolnker çıkış beklenen aralığı içindedir. </td></tr><tr><td> Kötü poliakrilamid hidrojel polimerizasyon. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Polimerizasyon süresi&gt; 10 dakika (4 W / m 2) artırmak. UV çapraz bağlayıcı çıkışı beklenen aralıkta olup olmadığını kontrol edin. </td></tr><tr><td> Poliakrilamid hidrojellerin coverglass çıkarıldıktan sonra zarar görmektedir. </td><td> Yumuşak poliakrilamid hidrojeller zarar kolaydır. </td><td> Biz özellikle (yani, 4 kPa) hidrojeller yumuşak hidrojel üretim verimi (~% 50) azalan gözlemlemek. nazikçe hidrojeller Kulp ve istenilen verimi elde etmek için başlangıç ​​sayısını artırmak. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Diziler 2. Fabrikasyon. </td><td rowspan="2"> Kötü veya tutarsız nokta morfolojisi. </td><td> Tutarsız nemlendirici fonksiyonu. </td><td> Bu nemlendirici kontrol edin ve her yazdırma çalışması boyunca işlevsel reometre ve% 65 RH korumak. </td></tr><tr><td> baskı kafası veya takunya sıkışmış pimleriged. </td><td> ücretsiz pim hareketine izin vermek için yazıcı kafasını temizleyin. iyice önce veya her baskı çalışmasından sonra temiz iğneler pim kanallarından agrega kaldırmak için. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Hücre Kültürü ve Tahlili Yürütme. </td><td rowspan="2"> İlk eki sonra diziler Hücre dekolmanı ya da ölüm. </td><td> Overseeding ve aşırı çoğalması. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini azaltın. hücre çoğalmasını azaltmak için dizi kültürü sırasında &quot;bakım&quot; veya &quot;farklılaşma&quot; ortamını kullanın. </td></tr><tr><td> hidrojel toksik akrilamid Yayın. </td><td> Akrilamid difüzyon / tahliyesine imkan vermek ve hücre toksisitesini azaltmak için en az 3 gün boyunca dH 2 O hidrojeller bekletin. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hücreler diziler eklemek gerekmez. </td><td> Underseeding. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini artırın. Bir daha güçlü yapışık hücre türünü kullanın. </td></tr><tr><td> Zayıf birikimimatris veya Biyomoleküllerin durum. </td><td> Parçacıkların ve agrega temiz iğne, baskı parametrelerini onaylamak ve floresan belirteçler, örneğin, rodamin-konjuge dekstran lekelenme değerlendirir. </td></tr><tr><td> hücre-matris etkileşimlerinin spesifikliği. </td><td> Farklı hücre tipleri, bazı ancak diğer ECM proteinleri spesifik olarak yapışır. senin hücreleri ile birden fazla farklı ECM proteinleri test edin. </td></tr><tr><td> imalattan sonra suboptimal dizi depolama. </td><td> Biz dondurma sırasında faz değişiklikleri önlemek için kısmen,% 65 RH ve oda sıcaklığında gece boyunca fabrikasyon dizileri saklamak öneririz. Hücre yapışması, her iki nem, sıcaklık ve depolama süresi karşı duyarlıdır; Bu parametreler deneyler için optimize / tutarlı olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücre kültürü sırasında cam alt tabakadan hidrojel dekolmanı. </td><td> Kötü slayt temizleme ve silanizasyon. </td><td> slayt temizliği için çalışan çözümler değiştirin vesilanizasyon. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hidrojel. </td><td> daha uzun 15-30 dakika süreyle sıcak bir plaka üzerinde kurutucu hidrojeller bırakmayın. </td></tr><tr><td> Verilerin 4. analizi. </td><td> tekrarlanan noktalar ve slaytlar arasında yüksek değişkenlik. </td><td> Dizi üretiminde değişkenliği. </td><td> pim ve yazıcı kafası temiz olup olmadığını kontrol edin. nemlendirici işlevi onaylayın. Görselleştirmek ve floresan işaretlerini kullanarak spot ve dizi kalitesini ölçmek. olarak saklayın dizileri yukarıda önerilir. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Sorun Giderme.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...