Name: rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00
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NS088206 및 ES026892 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 보조금에 의해 지원되었다. 더블유 유진과 린다 로이드 기증 의자 AGK하고 AK에 학장 교수도 인정된다.

동물 및 프로토콜 절차의 사용 승인과 기관 동물 케어 및 사용 아이오와 주립 대학위원회 (IACUC) (에임스, IA, USA)에 의해 감독되었다 1. 혼합 배양 성장 폐해 <ol><li> 5.5 인치 운영 가위 1 이일 된 새끼 빨리 목을 베다, 얼음에 50 ML의 튜브에 즉시 머리를 놓습니다. 이 잘린 안락사의 모드입니다 있습니다. </li><li> 층류 기류 후드, 두개골 및 4.5 인치의 직선 해부 마이크로 가?...

<ol>
	<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+from+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derive+from+progenitors,+originating+from+the+yolk+sac,+and+which+proliferate+in+the+brain.">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li><li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li><li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+new+roles+for+the+synaptic+stripper.">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li><li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson's+disease.">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li><li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration,+through+a+mechanism+involving+TNFalpha.">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).</li><li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson's+Disease.">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li><li>Moehle, M. S., West, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype.">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li><li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization.">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia.">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li><li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration.">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li><li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+cell+sorting:+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue.">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li><li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system.">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li><li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury.">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li><li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+epigenetic+regulation,+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson's+disease.">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li></ol>

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미세 아교 세포는 C-KIT + / CD45- 차별화 중배엽 기원 MYB 독립적 상주 식세포, 난황 1, 2의 혈액 섬 전구 세포를 erythromyeloid이다. 배아 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)을 식민되면, 그들은 분지 형태 3에 아메바에서 전환. 그들의 역동적 인 파급 효과가 잠재적 인 모욕 4 건강한 뇌 실질을 조사하고 있기 때문 성인 미세 아교 세포는 감시자로 분류됩니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계의 세포 인구의 약 10 %에 기여하지만, 서로의 사이에 타일에 대한 그들의 능력은 실질 4, 5의 최대 스캐닝을 보장합니다. 이러한 α-synuclein의 6, 7, 아밀로이드 β-8, P 등의 위험 - 관련 분자 패턴 (DAMPS)예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (9)와 같은 athogen - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)는 고전 아메바 액티브 상태로 복귀하고 산화 질소의 생산, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터루킨 1β 특징으로하는 염증 반응을 촉진하는 미세 아교 세포를 활성화 (IL-1β), IL-6, IL-12, 및 CC 케모카인 리간드 모티프 2 내지 9, 10, 11. 병원성 α-synuclein의 축적 가지고있는 파킨슨 병과 같은 신경 염증성 조건에서, 신경 퇴행성주기는 더 미세 아교 세포 (7)의 고전적인 활성화를 추진,보다 통합 된 α-synuclein의 출시 도파민 신경 세포의 죽음에서 생성됩니다. 주변 대 식세포와 마찬가지로, 미세 아교 세포는 대안 항 염증성 사이토 카인 IL-4 및 IL-10의 존재 하에서 활성화하는 능력을 갖고 그들에게 효능을 제공 할 수있다염증이 11 신경 수리를 장려하고 감쇠 IAL. 이외에도 CNS에서의 면역 학적 역할에서, 미세 아교 세포는 개발 과정에서 시냅스 가지 치기를하여 신경 회로의 중요 규제로 기술되었다. 예를 들어, Cx3cr1- KO 마우스는 저밀도 및 미세 아교 세포 돌기 쪽 미성숙 시냅스 및 미개발 CNS (12)의 전기 생리 패턴 넘쳐나 리드 감소 시냅스 치기를 갖는다. 중추 신경계의 항상성에 이러한 생리 학적 복잡성과 미세 아교 세포의 다양한 기능적 역할을 이해하는 것은 신경 퇴행성 질환을 대상으로 치료제에 대한 검색에 매우 중요합니다. neuroimmunology의 영역에서 생체 외 실험 때문에 역학적 연구에 대한 더 큰 가능성의 매우 바람직하며, 낮은 유지 보수 비용과 시간이 적게 걸리고 힘이 덜 드는 것에 대해. Furthermo다시, 세포 집단을 분리하는 능력은 소정의 조건에 따라 그 표적 세포의 기능을 묘사하는 것이 중요하다. 수많은 소교 분리 방법이 존재하지만, 그들은 광범위한 실험 13, 14, 15에 대해 상대적으로 높은 번호 및 순도를 얻을 수있는 능력에 의해 제한된다. 예를 들어, 분화 (11b)의 클러스터 (는 CD11b)는 단핵구, 대 식세포와 미세 아교 세포 (16)의 공통 표면 마커이다. CD11b를 악용하여 자기 분리하는 방법은 제 17 뇌 신생아 당 열 기반 접근법 수득 ~ 99.5 % 순도 및 ~ 1.6 × 106 미세 아교 세포로서 설명 하였다. 본 연구실은 최근 우리가 피코 에리 트린 접합하는 모노클로 날 항체 (PE)와 CD11b를 태깅하여 폴리스티렌 튜브에서 수행되는 열없는 CD11b를 자성 분리 방법 (15)을 개발 하였다. 특이 적 secondaRY 항체 PE 및 PE와 덱스 트란 착물한다. 일단 결합 된 덱스 트란 - 코팅 된 자성 입자는 항체 복합체의 덱스 트란 단부에 결합되는 도입된다. 마지막으로, 폴리스티렌 튜브는 미세 아교 분리를위한 자석에 배치됩니다. 이 방법은에 수율을 두 배로 ~ 신생아 뇌 당 만 ~ 97 %로 순도 감소의 비용으로 3.2 × 10 (6) 미세 아교 세포. 여기서, 우리는 신속하고 세련된 열이없는 CD11b를 자기 분리 프로토콜 (그림 1)를 보여줍니다. CD11b를 자기 분리 키트의 가격이 동일하기 때문에 이러한 개선 된 방법은 오리지널 열없는 방법처럼 가능한 남아있다. 완료 시간은 세포 생존 및 수율을 최대화 결정적 일 수 절반으로 감소된다. 특히,이 최적화 된 방법에서 얻어지는 ~ 순도&gt; 99 %, 15 실험실에서 개발 원래 열없는 방법에서 얻어지는 순도 이상 현저한 개선이다. 가장 중요한 것은, CD11b를-PE빛으로부터 배양의 필요성을 제거하고 형광 현미경에 대한 빨강 채널의 사용을 허용, 사용되지 않습니다. 마지막으로, 원래는 CD11b 방법에서와 같이, 높은 수율 및 순도의 성상 세포 분획이 개선 된 방법으로 얻어진다. 성상은 항상성 기능 병태 생리 (18)과 관련하여 필수 불가결하다는 생각을지도하는 CNS에서 가장 많은 신경 교세포이다. 이 아교 세포는 아교 자신의 조사의 가능성을 예시, 영양 지원을 제공, 혈액 - 뇌 장벽을 형성하는 신경 전달 물질의 항상성을 유지, 손상, 신경에 대한 응답으로 아교 흉터를 형성, 학습 및 메모리 및 신경 염증 등 다양한 생리 기능에 중요한 역할을 생물학 (19). 형태와 미세 아교 세포와 성상 세포의 기능은 공 초점 현미경, 웨스턴 블롯, 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR), G를 통해 확인되었다RIESS 아질산 분석하고, 루미 넥스 다중 사이토 카인 분석. 이 프로토콜에 의해 제공되는 정제는 시험관 실험에 중요한 모두, 미세 아교 또는 성상 세포의 순도, 빨강 채널의 가용성과 형광 현미경의 폭 넓은 응용에 관한 신뢰를 증가하고, 시간을 절약 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

미세 아교 세포는 중추 신경계에 욕설 차 응답자이다; 그러나, 많은 신경 염증을 조절하는 역할에 대한 알 수없는 남아있다. 미세 아교 세포는 염증 스트레스를 측량에서 대 식세포 유사한 기능을 중배엽 세포이다. 고전 (M1 형) 및 대체 (M2 형) 대 식세포의 활성화는 더 나은 이러한 표현형은 파킨슨 병, 알츠하이머, 헌팅턴의 질병과 같은 신경 염증성 조건이 기본 상호 작용을 이해하기위한 노력의 일환으로 미세 아교 세포로 확장되었습니다. 시험관 실험에서 생체 환경에 확장 될 수있다 신속하고 신뢰할 수있는 결과는 차 미세 아교 세포를 제공 활용. 이것은 도전했다 최적 순도 적당한 수율을 달성하면서 미세 아교 세포를 단리 생체 실험을 통해 명백한 장점 않는다. 현재 사용중인 일반적인 방법 중 하나는 낮은 복구, 낮은 순도, 또는 두 가지 모두에서 고통 받고 있습니다. 여기서, 우리는 민주시간의 절반의 양으로 높은 세포 복구 및 순도 향상을 달성 열없는 CD11b를 자기 분리 방법의 구체화를 onstrate. 우리는 신경 염증과 신경 퇴행을 연구의 목적으로 차 미세 아교 분리의 매우 유용한 모델로이 최적화 방법을 제안한다.

미세 아교 II는 높은 순도는 CD11b 양성 선택 키트를 사용하여 격리 기본 마우스 미세 아교 세포는 위에서 언급 한 프로토콜을 사용하여 절연 및 절연의 순도를 확인하는 폴리 D 라이신 코팅 커버 슬립에 도금했다. 만 개 세포를 단리 미세 아교 세포의 순도를 확인하기 위해 미세 아교 세포 및 성상 세포의 마커로서 글 리아 섬유 ?...

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Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

일차 운동 피질 대사에 양성 반구 경 두개 전기 자극 효과의 측정을위한 도구로 자기 공명 분광학의 사용

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

연구

신경과학

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

등갈 뿌리 신경절 대식세포의 신속한 절연

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

성인 쥐 요로 방광에서 1 차신경및 glia의 격리 그리고 문화

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...